Journal Club 06/11/2020
近年來，腫瘤的免疫治療作為一種創新的治療理念，已成為目前及今後腫瘤綜合治療的重要手段。免疫治療通過增強抗腫瘤免疫應答去識別和殺傷癌變細胞，不僅可有效清除手術無法完全清除或轉移的腫瘤細胞，且特異性強，毒副作用遠低於放化療。2018年，抑制免疫負調控治療腫瘤的研究成果被授予諾貝爾生理學或醫學獎，將腫瘤免疫治療的作用推向新的高度[1]。以PD-1/PD-L1為代表的T細胞免疫檢查點抑制劑為多種癌症的治療帶來了新的希望[2]，但仍然存在很多問題，包括腫瘤微環境中複雜的免疫抑制因素，部分癌症患者很少甚至幾乎沒有腫瘤浸潤T淋巴細胞等，限制了其療效。
除了淋巴細胞，腫瘤局部浸潤的固有淋巴樣細胞[3]、髓系細胞[4]等細胞群體在調控抗腫瘤免疫應答的過程中發揮了十分重要的作用。腫瘤浸潤髓系細胞參與免疫抑制微環境的形成，這些細胞在腫瘤中大量擴增，具有強大的免疫抑制功能並分泌促進腫瘤生長轉移的介質，其數量與臨床腫瘤進展及免疫治療效果密切相關，近年來備受關注[5]。其中，髓系來源的免疫抑制細胞（Myeloid-derived suppressor cell, MDSC）是一群不成熟的髓系細胞，可通過表達高水平的精氨酸酶-1（Arginase, Arg1）、表面抑制性分子（如PD-L1）等抑制CD8+T細胞介導的特異性抗腫瘤免疫應答[6]。
c-Rel（也稱Rel）是NF-κB家族中的一員，主要表達在髓系和淋巴系免疫細胞中。2020年5月18日，Nature Cancer雜誌發表了來自賓夕法尼亞大學陳有海教授團隊的研究成果：c-Rel is a myeloid checkpoint for cancer immunotherapy。該研究揭示了一種新的來自於MDSC的免疫檢查點—c-Rel。結果顯示，靶向MDSC中的轉錄因子c-Rel可逆轉MDSC的免疫抑制能力，促進效應T細胞介導的抗腫瘤免疫應答，抑制腫瘤的生長[7]。
1. 髓系特異性缺失c-Rel，可顯著抑制小鼠腫瘤的生長
作者首先對c-Rel全敲的小鼠，建立皮下黑色素瘤B16F10及淋巴瘤EL4模型，與WT小鼠相比，c-Rel缺失的小鼠，腫瘤生長明顯減弱（Fig.1 a-b）。然而，以往的研究證實，c-Rel參與調控Treg[8]、Th17[9]細胞的發育過程。並且，Treg缺失c-Rel已被證實能抑制腫瘤生長[10]。為了探究MDSC和Treg分別對腫瘤生長的影響，作者利用Gr-1和CD25的抗體對MDSC和Treg進行刪除，結果顯示，與IgG對照組相比，雖然二者均能逆轉c-Rel缺失導致的腫瘤生長抑制，但是MDSC刪除後這種變化更加明顯（Fig.1 a-e）。因此，作者利用Cre/loxP重組酶系統（LysM-cre）對小鼠髓系細胞的c-Rel進行條件性敲除，與前面的結論一致，髓系特異性缺失c-Rel的小鼠腫瘤生長得到明顯的抑制（Fig.1 f）。
2. c-Rel調節MDSC的發育、功能和代謝
作者利用條件性c-Rel敲除小鼠(conditional KO，cKO)建立腫瘤模型，結果發現，當與WT小鼠腫瘤長到相同大小時，cKO小鼠腫瘤和外周血中的MDSC（CD11b+Gr-1+）的比例均有下降（Fig.1 g-h），並且活化的效應T細胞比例上升（Fig.1 i-j）
Fig. 1 | Global and myeloid Rel gene deletion blocks tumor growth and reduces MDSCs in mice.
儘管MDSC的數目下降，但是依然有一定數量的MDSC存在，那這部分是否依然能有效抑制T細胞的功能呢？當腫瘤體積相同時，分選出MDSC與CD8+T細胞進行共培養，與WT MDSC相比，c-Rel缺失後的MDSC對T細胞的抑制能力明顯減弱（Fig.2 a）。同時，作者利用IL-6和GM-CSF體外誘導骨髓來源的MDSC，也得到了相同的結論（Fig.2 b）。然而，作者注意到，當c-Rel缺失後，其代謝狀態發生明顯轉變，與WT MDSC相比，KO的MDSC線粒體呼吸指標（OCR）下降（Fig.2 c-d），糖酵解指標（ECAR）明顯上升（Fig.2 e），這種效應與Warburg效應相似，一般活化的促炎性免疫細胞會採取這種供能迅速的代謝方式，比如M1型巨噬細胞。
Fig. 2 | Reduced suppressive function and altered metabolism of Rel-/- Gr-1+ myeloid cells.
作者對WT和KO小鼠骨髓來源的MDSC進行RNA-seq，比較二者轉錄組的差異（Fig.3 a）。結果顯示，Rel-/-MDSC促腫瘤的基因如：Arg1、Cebpb、Nos2等下調，這些基因大多富集在代謝通路（Fig.3 b-c）。而抗腫瘤的基因如Il1b、Tnfa、Il12p40等明顯上調，這些基因大多富集在炎症反應（Fig.3d-g）。GSEA分析顯示Rel-/-細胞失去了大多數MDSC的標誌基因，他們的轉錄組更像中性粒細胞（Fig.3 h-i）。
Fig. 3 | Loss of MDSC gene signatures from Rel-/- myeloid cells.
作者隨後在分選出的MDSC、體外誘導骨髓來源的MDSC中對測序結果予以驗證，發現c-Rel的缺失導致C/EBPβ、Arg1的mRNA和蛋白表達均下降（Fig.4 a-c），而炎性基因的表達顯著上調（Fig.4 d）。
3. c-Rel增強體（enhanceosome）特異性促進MDSC標誌基因的表達
c-Rel作為一個重要的轉錄因子，是否會直接參與Cebpb和Arg1的基因轉錄呢？作者利用ChIP和Re-ChIP實驗發現，c-Rel確實能激活Cebpb和Arg1基因的啟動子（Fig.4 e-g）。在MDSC分化發育過程中，在響應GM-CSF的刺激0.5h後，c-Rel對Cebpb和Arg1的結合就顯著增加，而其他轉錄因子C/EBPβ、p65、pSTAT3的結合要滯後於c-Rel（Fig.4 h-i）。然而，Re-ChIP實驗顯示，這些轉錄因子會形成單個增強複合體（Fig.4 j）。Co-IP實驗也驗證了c-Rel與NF-κB家族其他成員p65和p50的結合，但沒有結合RelB（Fig.4 k）。
Fig. 4 | c-Rel activates the MDSC signature genes Cebpb and Arg1.
陳有海教授在2009年12月發表的Immunity文章[8]解釋c-Rel對Treg發育調控和本文都提到了增強體（enhanceosome）這個概念。一個基因的轉錄可能由緊密增強子複合物形成的增強體控制，其中每個因子對轉錄是必不可少的。另外，也可能由多個模塊化的增強複合物組成，其中每個因素不依賴於其他因子，各自發揮的轉錄調控作用成為總的轉錄輸出，但這種模塊化增強子複合物可能無法有效地作為基因表達或系譜分化「開和關」的控制。因為c-Rel的缺失就足以明顯阻斷MDSC標誌性基因的表達，所以作者認為c-Rel通過增強體形式調控MDSC基因的表達。GM-CSF、IL-6、c-Rel、C/EBPβ、STAT3和NFAT6等因子都參與了MDSC的發育，但這些基因不是MDSC特異性的。與其他增強體一樣，含c-Rel的增強體也是作為「coincidence detectors」運作的，只有當所有的增強體因子都存在靶基因位點時（無論是按順序地或同時），c-Rel的靶基因才會轉錄，缺少其中任何一個都無法進行，這是MDSC發育過程中轉錄調控的特異性[11-13]。
c-Rel作為NF-κB家族的一員，通常被認為參與調控炎症的發生，然而，c-Rel缺失的MDSC反而獲得了促炎的表型。作者利用LPS去刺激WT與KO的骨髓來源巨噬細胞（BMDM），發現c-Rel缺失的巨噬細胞，在響應LPS刺激後，Il-1b和Il12p40的表達顯著降低，作者推測這可能是細胞類型或者譜系特異性帶來的差異。在BMDM中，在炎性基因Il12p40啟動子區域很容易檢測到c-Rel（Fig.5 a），而即便在IL-6和GM-CSF刺激後的MDSC中，c-Rel也不能在Il12p40啟動子區域檢測到（Fig.5 b），這提示了c-Rel對MDSC和BMDM的Il12p40基因可接近性是不同的。c-Rel缺失的MDSC中炎性基因的上調是因為控制MDSC發育的關鍵轉錄因子C/EBPβ表達下降，作者對c-Rel缺失的MDSC過表達Cebpb後，發現能恢復下遊基因的表達水平（Fig.5 c-h），增強線粒體呼吸，減弱糖酵解，對T細胞抑制能力增加（Fig.5 i-l）。
Fig. 5 | c-Rel regulates MDSC gene expression, metabolism and suppressive function via Cebpb.
4. c-Rel的抑制劑R96A能抑制腫瘤生長並增強PD-1抗體的療效
陳有海教授團隊曾經開發出c-Rel抑制劑R96A，在R96A給藥後，發現能顯著減弱小鼠黑色素瘤和淋巴瘤的生長（Fig.6 a-c），而這個效應在c-Rel全敲小鼠中是看不到的（Fig.6 d），證明這是c-Rel依賴的腫瘤抑制過程。並且，使用抑制劑後，確實能減少MDSC的產生、減弱對T細胞的抑制能力。另外，作者同時利用PD-1的單抗進行對照實驗，發現R96A的抗腫瘤效應與PD-1抗體的效應相近並且二者聯用有明顯的協同增強效應（Fig.6 e-f）。
Fig. 6 | c-Rel inhibitor blocks tumor growth and MDSC development, and enhances the effect of anti-PD1 therapy.
5. c-Rel的抑制劑R96A能夠減弱人源MDSC的免疫抑制功能
作者最後取人外周血單個核細胞（PBMC），利用IL-6和GM-CSF體外誘導成MDSC，在R96A處理後，MDSC對T細胞的免疫抑制能力顯著下降，並且，Arg1和C/EBPβ的mRNA表達也明顯下降。這提示了c-Rel的抑制劑有望作為髓系免疫檢查點，成為新一代腫瘤免疫治療的有效手段。
Fig. 7 | c-Rel inhibitor blocks human MDSCs.
最後，c-Rel抑制劑R96A雖然在體外實驗看到顯著的抗腫瘤效果，但是它在淋巴細胞和髓系細胞表達，並且對炎症反應的調控具有細胞類型特異性，因此，與現有的免疫治療手段類似，需要密切關注它的安全性，即在激活抗腫瘤免疫應答時，是否會因為炎症因子過度表達，甚至產生細胞因子風暴導致組織損傷，是否引起自身免疫疾病，這些都需要在臨床試驗中重點關注。
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撰稿/熊佳
編輯/koala