第二節 免疫鐵蛋白技術

2021-01-21 生物谷

第二節　免疫鐵蛋白技術

　　一、基本原理

　　鐵蛋白是一種含鐵約佔23%的蛋白質，分子量460kD,直徑10～12μm。抗體與鐵蛋白通過低分子量的雙功能試劑結合為一種雙分子複合物。此複合物既保留抗體的免疫活性，同時因為鐵蛋白含有緻密的鐵離子核心，鐵膠粒直徑核心為55～60nm含2000～3000個鐵原子，分布於四個區域，形成四個圓形緻密區，具有很高的電子密度，便於電鏡觀察。鐵蛋白來自許多動物，以肝、脾含量較高，其中馬脾臟含量最高。因而，商品鐵蛋白主要是從馬脾臟中提取的。

　　二、鐵蛋白的提取和純化

　　取健康的馬脾（新鮮或冰凍均可），去除脾外的淋巴結和脂肪組織，按溼重1：1.5或1：2加入蒸餾水，用組織勻漿器將組織勻漿，置水浴中加熱至75～85℃，使鐵蛋白以外的蛋白質變性，冷卻後用2～4層紗布過濾，濾液離心取上清液，每100ml上清液中加入35g硫酸銨，充分攪拌使鐵蛋白沉澱析出，4℃過夜，3000～10000r/min離心20min，棄去上清液，刮取沉澱物置透析袋內，剩餘沉澱物以蒸餾水洗後，一併加入透析袋內對水透析，除去硫酸銨。100ml中加入4～5g硫酸鎘使炎結晶，在室溫或4℃冰箱內使之出現鐵蛋白結晶。此鐵蛋白結晶以2%硫酸銨（pH5.58）溶解後，如上述再用硫酸鎘使之結晶。反覆溶解，結晶六次，達到純化。純化後鐵蛋白在半飽和的硫酸溶液內可保存1～2年。用時以蒸餾水透析除鹽後即可應用，應用前可以用負染色法在電鏡下觀察，了解鐵蛋白的完整性和純度。

　　商品製備的鐵蛋白是用2%硫酸銨溶液稀釋的1%～2%溶液（pH5.85）。為了在應用中得到滿意的結果，應用前必須將商品製備的鐵蛋白進一步純化。純化的方法是用0.1n NaOH或0.1n HCl調整pH值至5.85，然後加入20%硫酸鎘溶液使其在鐵蛋白液中最終濃度為5%硫酸鎘，此溶液置於4℃冰箱內2h（或過夜）至結晶完成，離心1h（2000r/min）充上清液。鐵蛋白結晶再溶解，離心除去不溶性顆粒，傾出上清液，加入5%硫酸鎘再結晶，至在顯微鏡下呈棕紅色鐵蛋白結晶為止。將結晶溶於2%硫酸銨溶液中，用50%5硫酸銨溶液沉澱三次，第三次沉澱形成的沉澱物溶於少量蒸餾水中，先對自來水透析，再對0.05mol/L,pH7.5磷酸緩衝透析12～24h。純化的鐵蛋白溶液用100000r/min 超速離心2h ，除去3/4無色上清液，沉澱物（內含鐵蛋白）在4℃過夜，待完全融解後，用微孔濾過器（Millipore filter, 孔徑 0.25～0.45μm）過濾，保存1～2年內仍可使用。

　　三、鐵蛋白與免疫球蛋白的結合

　　一般用低分子量的雙功能試劑把兩者聯結起來，常用的雙功能試劑有間苯二甲基二異氰酸鹽（簡寫XC）。甲苯2，4二異氰酸鹽（簡寫TC）。鄰茴香胺（簡寫BDD）；對，二氟一間，間，二硝基二苯礬（簡寫FNPS）和戊二醛。近年來，普遍認為戊二醛作為聯結劑效果較好，對抗體活性影響小，標記抗體產量高。分為一步法和二步法，現簡介如下：

　　1．一步法 　　以15mg 鐵蛋白和3mg球蛋白溶於0.9ml 0.1mol/L磷酸緩衝液中，pH7.0,加入0.1ml新鮮配製的戊二醛溶液，使其最終濃度為 0.005%～0.05%, 加入0.02%疊氮鈉（NaN3）防腐，此混合液置37℃24h，無需攪拌，結合完畢後加0.01mol/L賴氨酸中止反應。

　　2．二步法

　　（1）在含50～80mg鐵蛋白的0.1mol/L磷酸緩衝液（pH7.0）中，加入稀釋的戊二醛，使其最終濃度為0.05%～0.15%，總體積為1ml。

　　（2）置37℃作用2h後，經葡聚糖G—25 濾柱，除去未結合的戊二醛。為避免不必要的稀釋，只收集脫峰的中間部分。然後加入球蛋白（鐵蛋白與球蛋白之比為5：1）即鐵蛋白最終濃度為15mg/ml，球蛋白3mg/ml。

　　（3）混合液置37℃，作用12h（無需攪拌），加入0.01mol/L 的賴氨酸以中止進一步交聯。兩步反應都需在0.02% NaN2防腐條件下進行。

　　四、電鏡標本的製備方法

　　1．固定 　同常規電鏡一樣，應用醛類和四氧化鋨雙固定，以維持細胞和組織的超微結構。有文獻報告以4%的甲醛溶液在pH7.2的磷酸緩衝內，在0℃進行固定，並用四氧化鋨作後固定，不會影響抗原的反應能力。高錳酸鉀能使大部分抗原失去活性，一般不宜採用。另外，鐵蛋白標記抗體的特點之一是分子量大。因此，如用於細胞表面抗原的定位研究，可將樣品直接放入固定液，否則需採取適當的措施，打破細胞膜，增強細胞對標記抗體的通透性，常採取以下方法：

　　（1）凍融法：將小塊組織或細胞經固定後，凍融一次，使細胞膜破裂，標記抗體能進入細胞內。

　　（2）冰凍切片法：固定後組織快速冷凍，切成10～15μm左右薄片，溶化的切片直接浸泡於鐵蛋白標記抗體液中。

　　（3）有報導經戊乾杯固定後，浸入4×10-3mol/L洋地黃皂甙液中1～2min，能有助於增強細胞膜的穿透性，使標記抗體液進入細胞內。

　　2．免疫反應處理 　常用包埋前染色，分直接法和間接法兩種。在染色前，將組織切成約10～20μm厚的薄片。

　　（1）直接法：將薄片直接浸泡於標記抗體液中，室溫或37℃作用1～2h或更長；緩衝液（有人提倡用冷緩衝液）浸漂，除去未結合的標記抗體溶液，然後轉入常規雙固定和電鏡包埋。

　　（2）間接法：

　　①將組織切片浸於第一抗體液中，室溫30～60min。

　　②以大量冷緩衝液充分攪拌洗滌，至少3次，每次30min。

　　③浸入鐵蛋白標記抗體液中，室溫30min。

　　④如②，用緩衝液充分洗滌後，可以自然沉澱或用離心方法撈取組織片。

　　⑤將離心沉澱小塊，用四氧化鋨固定30min。

　　⑥常規電鏡脫水、包埋、切片、染色和觀察。

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