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https://www.nature.com/articles/ng.3884
在基因組上，基因的表達受到近端的啟動子和遠端的增強子共同調控。近年來，一些研究發現部分啟動子可能具有增強子活性。為了在全基因組鑑別有增強子功能的啟動子，來自法國Aix-Marseille大學的Salvatore Spicuglia課題組，利用體外報告系統篩選，結合體內CRISPR-Cas9，在小鼠和人類細胞中篩選鑑定出了一系列具有增強子功能的啟動子，它們可激活遠端的基因。該工作揭示了基因組上精細的轉錄調控過程，將有助於我們理解機體發育與疾病發生發展過程。
一、 在小鼠細胞中發現部分啟動子有增強子活性
為鑑定出基因組上的增強子序列，Salvatore Spicuglia課題組此前開發了一項體外報告系統，叫做CapStarr-seq (Captured self-transcribing active regulatory region sequencing)[1, 2]，如圖1所示[3, 4]。
圖 1 CapStarr-seq流程圖
CapStarr-seq流程如下：
研究者將基因組打斷（本文用DNase I酶切基因組DNA，富集出的DNA即為染色質開放程度較高的DNA，即DHS，DNase I hypersensitivity sites）；
合成< 150bp 的DNA 探針，用DNA microarray的方法，把打斷的基因組雜交出來，作為待鑑定的增強子（圖1a前兩步）；
構建報告質粒：利用增強子無論在基因的上遊還是下遊，均可激活靶基因轉錄的特性，將待鑑定的增強子放在報告基因的3』端，和報告基因GFP融合在一起（圖1a第三步，圖1b）。將質粒轉染目的細胞。
用流式細胞術分選出GFP高表達的細胞，進行RNA-seq。同時檢測轉染到細胞內的待鑑定增強子的DNA量。
報告質粒會轉錄出GFP融合待鑑定增強子的RNA（圖1C）。通過RNA-seq可以獲知融合RNA的序列及豐度，將該豐度除以轉染的DNA量，即可得知待鑑定的增強子是否具有增強子活性，是否可激活GFP表達，及其活性。
該方法的優點是：可以大規模篩選、鑑定基因組中的增強子；用探針雜交的方法捕獲待鑑定的增強子序列，節省了合成DNA的成本；待鑑定的增強子序列可以通過RNA-seq測到，因此不需要額外給每個增強子序列設計標籤序列，節省人力物力。缺點是無法考慮體內染色質環境的影響。而且融合表達的增強子序列可能會影響RNA穩定性。
增強子研究的更多方法，歡迎點擊：Plus深讀 | Nature Biotech: 如何研究基因組中的非編碼序列？
在本文中，研究者將小鼠T細胞系P5424的基因組切斷，捕獲DHS序列，分為兩類：啟動子近端序列（距離TSS < 1kb）和遠端序列（距離TSS > 1kb）。構建報告質粒，轉染小鼠T細胞系P5424和小鼠胚胎成纖維細胞系NIH-3T3，進行RNA-seq，比較來自T細胞系的兩類DHS序列，在兩種不同細胞內的增強子活性。
研究發現，具有增強子活性的遠端DHS序列具有更強的組織特異性，而近端序列的組織特異性較弱。這體現在：來自T細胞的遠端增強子上富集淋巴轉錄因子的結合（如ETS1，HEB），而近端序列則缺少這些轉錄因子的結合（圖2a）；來自T細胞的遠端序列更多地只在T細胞中具有增強子活性、在胚胎成纖維細胞中無增強子活性，而近端序列則更多地在兩種細胞系中都有增強子活性（圖2b-2d）。
圖 2 具有增強子活性的遠端DHS序列具有更強的組織特異性 | (a)T細胞中的淋巴轉錄因子的ChIP-seq表明它們更富集在具有增強子活性的遠端DHS序列上。(b) 棕色部分是在兩種細胞系中都有增強子活性的DHS，其中近端DHS的棕色比例高於遠端DHS。(c,d) 表明來自T細胞的DHS序列轉入胚胎成纖維細胞後的增強子活性，仍然是遠端序列弱於近端序列，表明遠端序列的組織特異性更強。
研究還發現，具備增強子活性的近端DHS序列大多分布在TSS上遊300bp至下遊100bp，基本與核心啟動子區重疊。因此，研究者把這些具備增強子活性的啟動子稱為Epromoter。下面，研究者將用該方法鑑定人源細胞K562和HeLa中的Epromoters，並研究其特徵和功能。
二、在人源細胞中鑑定具有增強子活性的啟動子
研究者在ENCODE計劃所用細胞系：人類髓性白血病細胞系K562和人類宮頸癌細胞系HeLa中篩選鑑定Epromoters。
他們將K562和HeLa細胞的基因組打斷，捕獲TSS -200bp至+50bp的DNA序列，進行CapStarr-seq。最終，他們在20719個啟動子中，篩選到632個K562的Epromoters，以及493個HeLa的Epromoters，兩者交集為146個。這些Epromoters與對照組啟動子（基因有相同轉錄活性、非Epromoters的啟動子）相比，CpG島的比例無明顯差別，物種間保守性也無明顯差別。
三、Epromoter的表觀基因組學和基因組學特徵分析
研究者針對Epromoter的表觀基因組進行分析，發現Epromoter有更高的p300（H3K27ac乙醯化酶）結合水平（圖3a），更高的H3K4me1和H3K27ac水平（圖3b），具備增強子的表觀遺傳學特徵。並且來自K562的Epromoter序列轉染K562細胞的增強子活性要強於轉染HeLa細胞，HeLa Epromoter也是轉染HeLa更強（圖3c），說明Epromoter還是具有一定的組織特異性的。
圖 3（上）Epromoter具備增強子的表觀遺傳學特徵
在HeLa中進行5』GRO-seq發現Epromoter有更高比例的反向轉錄（divergent transcription），這也是活躍的增強子的一個特徵。
針對Epromoter近端基因進行GO聚類分析（圖3d），發現其首先富集在一些基本生命過程相關的基因上（如肌動蛋白微絲相關基因，細胞代謝過程）。這和此前在果蠅的Starr-seq的結論相符，一些持家基因的啟動子可發揮增強子功能。此外，K562和HeLa的Epromoter的富集通路也有各自的獨特性。K562的Epromoter特異地富集在應激相關基因上，而HeLa的Epromoter特異地富集在I型和II型幹擾素應答基因、病毒相關基因、病毒防禦基因上。HeLa細胞確實高表達很多幹擾素應答基因，而K562並沒有，這可能是因為HeLa細胞來源於乳頭瘤病毒感染的腫瘤細胞。此外，Epromoter還富集很多轉錄因子的motif（圖3e），這也和增強子類似。
圖 3（下）Epromoter具備增強子的表觀遺傳學特徵 | (d) K562和HeLa的Epromoter近端基因的聚類分析。(e) K562和HeLa的Epromoter上富集的轉錄因子motif。
下面，研究者發現Epromoter近端基因的轉錄活性並不比非Epromoter更高（圖4a）； K562或HeLa特異性的Epromoter近端基因的轉錄活性，在兩種細胞系中也差不多（圖4b），這表明Epromoter可能並不是近端基因的增強子。通過Pol II、H3K4me3、RAD21 ChIA-PET發現，Epromoter比非Epromoter在遠端基因有更強的啟動子-啟動子相互作用（圖4c）。這提示Epromoter是遠端基因的增強子。
圖 4 Epromoter的近端基因表達情況，以及啟動子-啟動子相互作用。
四、 在體內驗證Epromoter是真實的增強子
研究者以FAF2基因的Epromoter為例進行研究。他們用Pol II ChIA-PET發現該Epromoter與基因NOP16, CLTB 和RNF44的啟動子有相互作用（圖5a）。為了研究該Epromoter在體內是不是增強子，他們用CRISPR-cas9將該Epromoter切除，發現NOP16在Hela中的表達下降，RNF44在Hela及K562中的表達都下降（圖5b）。這提示FAF2 Epromoter可能是RNF44的增強子。切除FAF2基因的Epromoter後，RNF44啟動子的H3K27ac水平下降（圖5c）。4C-seq也發現WT細胞的FAF2基因的Epromoter與RNF44啟動子有互作，但切除Epromoter後互作消失（圖5d）。最後，研究者又構建了體外luciferase報告系統，證明該Epromoter可以激活RNF44的啟動子（圖5e）。而如果切除RNF44的啟動子，FAF2的表達不受影響（圖5f），表明FAF2 Epromoter對RNF44的調控作用是單向的。
這些結果證明了FAF2基因的Epromoter是距其88kb處的RNF44基因的增強子。
圖 5 FAF2基因的Epromoter是距其88kb處的RNF44基因的增強子
那麼該Epromoter作為增強子時，有沒有方向呢？為了解答這一問題，研究者將FAF2的Epromoter在基因組上翻轉了過來，發現翻轉後，RNF44的表達會下降（圖6a），但還是高於Epromoter切除後的表達量（圖6b）。這說明該Epromoter有一定方向性。
此外，過表達FAF2無法回復由於Epromoter切除或翻轉引起的RNF44下調（圖6b），證明RNF44並不是受FAF2基因調控的。
圖 6 FAF2 Epromoter有一定的方向性
五、Epromoter可調控遠端的幹擾素響應基因
研究者利用ChIA-PET尋找Epromoter的靶基因（圖7a），找到K562和HeLa的Epromoter的遠端靶基因中，分別有18個和56個是幹擾素調控基因（圖7b）。
例如在K562中，SERPING1基因的Epromoter的遠端靶基因是幹擾素響應基因UBE2L6，METTL21A的遠端靶基因是幹擾素響應基因CCNYL1。這些幹擾素響應基因在TNF-alpha的刺激下會被激活。但如果切除對應的Epromoter，UBE2L6和CCNYL1就不能在TNF-alpha的刺激下激活（圖7c, 7d）。
這進一步證明了Epromoter對遠端基因有順式調控作用。
圖 7 Epromoter可調控遠端的幹擾素響應基因
最後，研究者發現SNP可以影響Epromoter的活性，當把K562細胞的Epromoter的SNP突變，會導致Epromoter的靶基因的表達下調（圖8）。這提示Epromoter中的疾病相關的SNP可能影響遠端的基因表達，可能有助於我們更好地研究疾病的發生發展機制，
圖 8 把K562細胞的Epromoter的SNP突變，會導致Epromoter的靶基因的表達下調
延伸思考
1.本研究通過高通量報告系統篩選了小鼠和人類細胞中，可能具有增強子功能，激活遠端基因表達的啟動子，將其命名為Epromoter。研究者鑑定了這些Epromoter的獨特的基因組學和表觀遺傳學特徵，以及SNP對其產生的影響，證明了部分啟動子可以作為增強子，以及CapStarr-seq可以很好地用於篩選增強子。本研究揭示了基因組上精細的轉錄調控過程，將有助於我們理解機體發育與疾病發生發展過程。
2.本研究提示，啟動子可能存在成簇激活的情況。這或許有利於轉錄機器更高效地完成轉錄。但值得注意的是，成簇激活的啟動子可能並非互相激活。本文發現F2F Epromoter可以調控RNF44，但反之則不行。說明它們之間還是存在dominance的。此外，Epromoter調控的近端與遠端基因，或許功能上存在聯繫，使得他們經常需要被一起激活，同時這種成簇激活還存在上下遊關係。後續工作可以對其生物學功能展開更多研究。
3.lncRNA的啟動子也有可能發揮增強子的作用。2016年，Eric Lander 和 Eric Olson分別在Nature上發表的兩篇論文，及Mitchell Weiss在Molecular Cell 發表的論文，都分別提出了這一設想[5-7]。如lncRNA linc1536/Bendr的啟動子可以調控35kb外的基因Bend4的轉錄，lncRNA Uph的啟動子也可以調控Hand2的表達。以前研究lncRNA的作用，經常採用刪除lncRNA（或其promoter）的做法。這樣看到的表型，其實並不一定對應lncRNA作為RNA的功能，還有可能是其作為調控元件的作用，或其轉錄過程對其他基因的調控作用。所以，或許可以採用antisense-oligo（ASO）在核內敲低lncRNA來進行研究。此外，還可以rescue lncRNA（通過質粒，或者整合到基因組的其他位置產生核內lnRNA）作為對照。
（更多內容歡迎點擊：【Plus深讀】lncRNA：不只是RNA——三篇重磅文章齊解讀 ）
4.後期工作還可以研究Epromoter和遠端啟動子之間的染色質高級結構如何被調控，與基因間區的經典增強子-啟動子互作有何異同。
5.可以在DNA序列上分析Epromoter與基因間區的經典增強子的關係，推測增強子的起源機制（部分增強子也許源於啟動子的複製、易位，Epromoter也許是比較原始的增強子模式）。
有關增強子的更多研究，可參考：
Plus深讀 | Mol Cell: Mll3/4催化的H3K4me1對增強子活性不必要
Plus深讀 | eRNA激活增強子的乙醯化？
【Plus深讀】Nature Comm：原發性胃癌的超級增強子異質性分析
參考文獻
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[6] ANDERSON K M, ANDERSON D M, MCANALLY J R, et al. Transcription of the non-coding RNA upperhand controls Hand2 expression and heart development[J]. Nature, 2016,539(7629):433-436.
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