Nat Metab | 胰島β細胞分化程序和譜系分支

2020-12-02 BioArt

責編 | 兮


正常胰島β細胞分泌胰島素使血糖維持正常水平。β細胞的破壞和功能異常會導致糖尿病發生，然而目前並沒有療法能夠直接修復β細胞的數量與功能。幹細胞誘導分化至可移植的胰島β細胞有望成為新型糖尿病細胞療法。此外，幹細胞分化系統也是研究人類胰腺發育的理想工具，該系統可以在很大程度上模擬體內胰腺發育的關鍵發育階段。


但是，當前用於誘導β細胞分化的方案仍然具有一定局限（i）分化產生異質細胞群；（ii）在不同的hESC或iPSC品系之間，分化效率可能存在很大差異。（iii）在分子和生理水平上，所得的β樣細胞仍不完全等同於原代β細胞。


誘導β細胞分化過程中涉及多樣的分化譜系與異質的細胞群體，我們仍然缺乏細胞分化路徑選擇的全局分子圖景，因此仍然難以有效控制分化過程 （例如非內分泌譜系中的未知分子事件可能會顯著影響分化效率）。


2020年11月30日，來自凱斯西儲大學醫學院的李妍團隊和靳伏錸團隊聯合在Nature Metabolism上發表題為Single cell lineage analysis reveals extensive multimodal transcriptional control during directed β-cell differentiation的研究論文。該工作使用人類胚胎幹細胞定向誘導胰島β細胞體外分化並使用單細胞RNA 測序技術（Drop-Seq）重建完整分化譜系樹，從而系統地揭示了分化程序和譜系分支。該研究鑑定了細胞分化路徑選擇的 「開關」 基因，並據此優化了現有誘導分化方案、揭示了影響分化效率的分子機制。值得強調的是，該研究發現在β樣細胞分化主幹路徑上，有大量基因呈現表達 「雙峰」，表明這些基因在分化過程的不同時間被激活多次並可能行使差異功能。



團隊使用人類胚胎幹細胞品系H1進行分化，其特點是β細胞分化產量中等，細胞異質性高，這提供了足夠的細胞群體覆蓋率以分析完整細胞命運選擇。該研究使用單細胞RNA 測序技術（Drop-Seq）在分化過程中選取12個時間點（跨越31天）進行實驗，並獲取95,308個單細胞轉錄組數據（圖1a-c）。


研究人員首先在單細胞水平比較了幹細胞誘導細胞群與原代胰島細胞，發現幹細胞誘導α樣和β樣細胞在轉錄組水平高度相似於人類原代α和β細胞 （圖1d-f），並且表達近似水平的荷爾蒙基因（胰島素基因 INS和胰高血糖素GCG）。但是進一步分析顯示仍然有上百基因相較於原代細胞差異表達， 例如PAX4基因的過表達以及MAFA基因的表達不足（圖1g-h）。過表達基因多富集於肝組織發育相關功能(肝組織與胰腺在胚胎發育時空上相近)，而低表達基因則富集於分泌泡相關功能（敏感的分泌功能是成熟β的標誌），這表明幹細胞誘導β樣細胞仍需進一步體外成熟 （圖1i-j）。


圖1誘導胚胎幹細胞至β樣細胞分化單細胞轉錄組圖譜


為解析細胞間的分化關係並重建分化過程，研究人員開發新算法重構了具有高度分支結構的胰島分化譜系樹，根據在分化譜系樹上的時空表達關係，研究者將所有基因分為64個表達模塊，每個模塊包含約兩百個基因。例如，該分析鑑定了早期幹細胞模塊、內胚層發育模塊、胰腺內分泌發育模塊、胰腺非內分泌發育模塊等（圖2a）。根據重構的譜系樹，團隊研究了β樣細胞分化主幹路徑並鑑定了6872基因在不同時間出現單一表達峰（圖2b），其中769個為轉錄因子，研究者進一步分析了H3K27ac ChIP-seq並發現轉錄因子DNA的結合基序在表觀遺傳水平顯示一致的單峰激活， 這表明大量基因調控具有高度時序特異性（圖2e）。進一步與糖尿病全基因組關聯分析（GWAS）整合發現，有大量糖尿病相關基因富集於分化時序中段，表明有許多糖尿病基因有可能在早期胰島發育過程中發揮作用（圖1d）。



圖2:胰島分化譜系樹基因表達時序分析


為了闡明分化效率機制，研究人員系統比較了胰腺內分泌分化路徑與非內分泌分化路徑。該分析鑑定了約兩千個在分化路徑選擇上有顯著表達差異的 「開關「基因（圖3a-b）。內分泌路徑主要上調表達分泌、胞吐、鈣離子通道相關基因，而非內分泌路徑主要上調消化系統、上皮細胞分化等相關基因（圖3c）。


圖3: 細胞分化路徑分析鑑定 「開關」基因


在這些分化路徑開關基因中，轉錄因子尤為重要。該研究鑑定了主要胰腺內分泌路徑轉錄因子，包括已知的PDX1、NEUROG3、RFX3、NEUROD1、PAX4基因等（圖3d）。HES1基因是在非內分泌路徑上顯著上調表達的 「開關」 轉錄因子（圖3d, 4b）。已知HES1 是NOTCH 信號通路的下遊轉錄調控因子，並且NOTCH基因也在非內分泌路徑上顯著上調（圖4a）。研究者因此猜想HES1的特異表達可能促進非內分泌而抑制內分泌分化路徑（β樣細胞位於該路徑終端），於是團隊利用CRISPR-Cas9技術建立HES1-KO穩定幹細胞系並發現HES1敲除確實顯著提高內分泌細胞分化（圖4c）。此外，根據HES1 在譜系樹上的表達時間，研究者優化了NOTCH 信號通路抑制時間並成功提高分化效率（圖4d-e）。


圖4: 基於HES1表達時序優化內分泌細胞分化效率


此外，研究者還闡明了另一種促分化效率因子 ROCKII 抑制因子的分子機制並建立了最優抑制時間。研究者發現ROCKII 抑制因子特異性下調了非內分泌細胞的生長與增殖相關的基因進而特異性抑制了非內分泌譜系從而促進了內分泌細胞比例（包括終端β樣細胞）（圖5）。


圖5: ROCKII 抑制因子通過抑制非內分泌細胞分化路徑促進內分泌細胞分化


尤其有意思的是，在β樣細胞分化主幹路徑上，研究者發現多達2200個基因具有表達雙峰，並且這些基因的啟動子活性（根據H3K27ac ChIP-Seq）也顯示類雙峰樣波動，這表明有大量基因可能在不同時間被激活多次並可能行使有差異的功能（圖6a-b）。研究者發現有相當數目的雙峰基因只在內分泌譜系被二次激活，表明被二次激活的基因具有功能特異性（圖6c-d）。此外，研究者還發現雙峰基因的二次激活常伴隨著時序特異性的不同增強子（圖6e-l）。


圖6: 鑑定β細胞分化過程中雙表達峰基因，其雙表達峰由時序特異性增強子和啟動子驅動


TCF7L2 基因顯示典型的雙峰表達（圖7a）。值得強調的是， TCF7L2 是目前和糖尿病關聯性最高的基因之一，但是其影響疾病風險的機制尚不清楚。該分析顯示，TCF7L2 首先在幹細胞內表達，短暫下調後於胰腺祖細胞被重新激活。研究者發現TCF7L2的二次激活受一個高度時間特異的增強子E4調控，並且該增強子位於糖尿病高風險的連鎖不平衡遺傳區（圖7b）。E4增強子敲除導致TCF7L2的第二表達峰消失（圖7c-e）並導致胰島內分泌細胞增多（圖7f），這提示位於TCF7L2的遺傳多態性可能通過影響胰腺發育過程造成不同程度的糖尿病風險


圖7: 時序特異性增前子於TCF7L2區域驅動其於胰腺祖細胞激活表達


總之，該研究對幹細胞誘導分化β樣細胞進行了單細胞水平的轉錄組以及基因調控研究，該研究提供分化過程完整時序基因表達數據並重構了多分枝樣譜系樹。通過分析發現分化路徑選擇機制並提高了分化效率。該發現為有望推進糖尿病幹細胞療法並為糖尿病致病機理提供分子依據。


凱斯西儲大學醫學院李妍、靳伏錸為本文共同通訊作者，博士生翁琛、博士後席甲甲為本文共同第一作者。


原文連結：

https://www.nature.com/articles/s42255-020-00314-2

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