高效靶向激活肝細胞內源基因直接重編程為胰島樣細胞

2020-12-10 中國組織工程研究雜誌


文題釋義：

Casilio系統：由成簇規律間隔短回文重複(clustered regularly interspaced palindromic repeats，CRISPR)/核酸內切酶失活的Cas9(nuclease-dead mutants of Cas9，dCas9)、至少一個單鏈嚮導RNA (single guide，sgRNA)和Casilio模塊(效應蛋白與PUF蛋白(Pumilio/FBF)的融合蛋白)組成，是利用保守的PUF RNA結合域識別並結合特異性RNA序列(PBS)的特性，通過設計帶有不同PBS的sgRNA，結合不同的PUF來招募效應蛋白從而可以在不同的位點實現多基因的同時調控，可以招募多個同種效應蛋白，使其效應增強，也可以招募不同的效應蛋白，協同調控基因表達。

轉錄因子Pdx1/Ngn3/MafA(PNM)：轉錄因子(Transcription Factor，TF)是一群能與基因5』 端上遊特定序列專一性結合，從而保證目的基因以特定的強度在特定的時間與空間表達的蛋白質分子。胰十二指腸同源盒(Pancreatic and duodenal homeobox,Pdx1)、神經元素3(Neurogenin 3，Ngn3)、肌腱膜纖維肉瘤癌基因同系物A(V-Maf Avian Musculoaponeurotic Fibrosarcoma Oncogene Homolog A,MafA)等胰腺發育關鍵轉錄因子常被作為肝細胞直接重編程為胰腺β細胞的目標基因。

背景：胰島細胞移植是治療糖尿病最有效的方法之一，然而移植細胞來源短缺限制了其臨床應用。在體外進行肝細胞向胰島β細胞的直接重編程是解決該問題的一個新思路，但肝細胞向胰島β細胞分化是一個複雜的過程。

目的：利用構建的CRISPR/dCas9-Pumilio系統(Casilio系統)，通過改造嚮導RNA序列，與轉錄激活子PUFa-P65-HSF1結合，實現高效靶向激活肝細胞內源基因直接重編程為胰島樣細胞。

方法：採用脂質體轉染法將Casilio體系(PNM)轉染至HEK293T細胞系，靶向激活肝細胞內源PNM(Pdx1，Ngn3及MafA)基因，利用實時螢光定量PCR及免疫螢光檢測內源PNM的表達。利用攜帶Ins-promoter-EGFP的慢病毒構建增強型綠色螢光蛋白穩定表達的Ins-EGFP HepG2細胞系，PiggyBac(PB)轉座系統在此細胞系中構建核酸內切酶失活的Cas9(dCas9)和PUFa-P65-HSF1穩定表達的穩轉細胞系。用脂質體向穩轉細胞系分別轉染針對PNM的嚮導RNA，然後實時螢光定量PCR和免疫螢光檢測內源基因PNM的表達水平，並觀察重編程效率。

結果與結論：①實驗在293T細胞系中驗證了Casilio體系對內源基因的激活作用；②RT-PCR、Western Blot及免疫螢光檢測驗證了穩轉細胞系中EGFP、dCas9和PUFa-P65-HSF1的表達；③實時螢光定量PCR證實靶向激活PNM的新型Casilio體系可實現內源PNM基因表達明顯上調，直接重編程效率為10%-15%；④上述數據說明基於CRISPR/dCas9的新型Casilio體系，可成功激活肝臟內源PNM基因，可初步實現肝細胞系直接重編程為胰島樣細胞。

https://orcid.org/0000-0003-4891-324X(王晗月)

中國組織工程研究雜誌出版內容重點：幹細胞；骨髓幹細胞；造血幹細胞；脂肪幹細胞；腫瘤幹細胞；胚胎幹細胞；臍帶臍血幹細胞；幹細胞誘導；幹細胞分化；組織工程

關鍵詞: 體細胞, 胰島樣細胞, 肝, 細胞基因轉染, 糖尿病, CRISPR/dCas9, 因子, 蛋白, 通路

文章來源：王晗月, 李富榮, 楊曉菲, 胡巢鳳. 高效靶向激活肝細胞內源基因直接重編程為胰島樣細胞[J]. 中國組織工程研究, 2021, 25(7): 1056-1063.

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