新平臺新研究∣新單細胞平臺助力挖掘治療血管疾病新靶點

　　近幾年，單細胞測序領域發展迅速，最近的研究表明，每個細胞都是獨一無二的。即使是同類型細胞，基因表達也會出現差異。今天小編帶領大家一起解讀最新發表在《Circulation》雜誌上的一篇有關使用WaferGen ICELL8單細胞捕獲分選平臺研究血管疾病的一篇文章。

　　研究簡介

　　2018年6月5日，中國醫學科學院阜外心血管病醫院王利研究組在《Circulation》雜誌發表了題為「Histone Variant H2A.Z is Required for the Maintenance of Smooth Muscle Cell Identity as Revealed by Single-Cell Transcriptomics」的研究論文。該研究基於單細胞轉錄水平分析患者動脈中的血管平滑肌細胞（VSMC）群體，鑑定了維持VSMC特性的新的關鍵調控因子-組蛋白變體H2A.Z。關於該組蛋白變體H2A.Z是如何參與細胞命運決定的，作者提出了對VSMC命運起到決定作用的轉錄調控模型。該研究成果不僅提供了關於組蛋白變體在維持細胞特性中的調節作用的新見解，同時開闢了預防和幹預血管疾病的新途徑。

　　背景

　　血管平滑肌細胞（VSMC）具有顯著的可塑性，使得VSMC能夠參與血管發育和疾病發生的多種分子事件當中。通常情況下，VSMC通過表達收縮基因來穩定分化表型以維持血管的收縮；在血管損傷或重塑時，VSMC的表型發生轉換。理解VSMC如何維持細胞特性可以幫助我們預防或治療血管再狹窄和動脈粥樣硬化等血管疾病。前期的研究主要基於組織樣本，病變組織的異質性信息常常被掩蓋，因此迫切需求在單細胞解析度下研究血管病變組織中細胞的特徵，將由於細胞間差異而隱藏的未被認知的分子特徵突出顯示，從而揭示在調節血管穩態和疾病發生中起作用的新調控因子。

　　研究手段

　　單細胞RNA-Seq：

　　2名動脈粥樣硬化患者病變組織，共計551個單細胞，385個單細胞質控合格用於後續研究；

　　單細胞捕獲分選平臺2：WaferGen ICELL8

　　NextSeq500 sequencer (Illumina) PE26和PE50

　　ChIP-seq：

　　NextSeq500 sequencer (Illumina), PE35

　　RNA-Seq：

　　NextSeq500 sequencer(Illumina)，PE35

　　結果1-單細胞RNA測序揭示H2A.Z和VSMC特性之間較強的相關性

　　本研究對2名患者的385個單細胞進行測序，測序深度約為0.53M reads/細胞，基因的檢測數目約為2,540個/細胞。通過tSNE分析將收集的細胞分為3個不同的細胞群（圖1A）。 其中免疫細胞標記基因主要集中在C2和C3群，經典的VSMC標記基因主要集中在C1（圖1B）。有趣的是，IPA分析顯示C1群中的特異性基因顯著富集在血管發育和形態通路，表明C1細胞具有VSMC特徵（圖1C）。為了進一步確定決定VSMC特性的關鍵調節因子，作者根據細胞中ACTA2表達量情況將C1細胞分為兩個亞群， 在ACTA2High與ACTA2Low相比440個顯著上調的基因中，作者意外的發現了組蛋白變體（圖1D）。對所有組蛋白變體表達分析發現H2AFZ在ACTA2High亞群中顯著表達（p = 0.02），表明H2A.Z基因表達與VSMC特性之間較強的相關性（圖1E）。與IMA對照相比，CEA中H2A.Z陽性細胞核的數量顯著減少，同時VSMC標記基因ACTA2的表達降低（圖1G和1H），同時在CEA中H2AFZmRNA水平顯著降低，幾種VSMC標記基因的表達受損（圖1I）。上述結果表明H2A.Z與VSMC特性之間存在較強的相關性。

　　圖1.單細胞RNA測序揭示H2A.Z和VSMC特性之間較強的相關性

　　結果2-H2A.Z直接調節VSMC特異性基因的表達

　　上述結果揭示了H2A.Z表達與VSMC特性之間較強的相關性，但兩者的因果關係未確定。H2afz沉默材料的RNA-seq結果顯示2/3的差異基因是下調表達，且幾乎所有VSMC標記基因劃分到這一類差異基因中，而與去分化相關的標記基因上調表達（圖2A），圖2B是對RNA-seq結果的進一步驗證。為了理解H2A.Z如何影響VSMC特性，在對H2A.Z KD和兩種治療方式引起的基因表達變化的比較發現，H2A.Z KD與導致VSMC特性的喪失的這兩種治療方式相關性顯著。暗示了H2A.Z在維持VSMC特性中的關鍵作用（圖2D）。為了驗證H2A.Z是否直接調控特異基因，進行ChIP-seq。圖(2E-2F)表明H2A.Z佔據VSMC標記基因附近且在基因表達中起到激活作用。在935個H2A.Z KD-抑制表達的基因中，803個在脈管系統發育途徑顯著富集的基因是被H2A.Z所佔據的，推測VSMC標記基因是H2A.Z直接調節的靶標(圖2G-2H)。

　　圖2.H2A.Z直接調節VSMC特異性基因的表達

　　結果3-H2A.Z佔有率的動態變化與VSMC表型轉換密切相關

　　鑑於H2A.Z在激活VSMC標記基因表達中的重要作用，作者試圖確定H2A.Z是否與VSMC表型轉換相關。對P1和P10時期VSMC的H2A.Z進行ChIP-Seq表明H2A.Z由佔據肌肉組織發育相關的基因轉換到其他類型基因上；與P1時期相比，P10時期這些基因的表達在減少而SRF結合位點沒有變化(圖3A-3E)。綜合上述結果：當SRF結合沒有變化時，H2A.Z佔有率顯著下降，VSMC特異性基因表達減少，推測H2A.Z通過特異性調控基因表達來調控血管平滑肌細胞命運（圖3G-3I）。

　　圖3. H2A.Z佔有率的動態變化與VSMC表型轉換密切相關

　　結果4-H2A.Z降低VSMC標記基因的核小體佔有率

　　為了剖析H2A.Z-激活的基因表達的分子基礎，作者觀察在P1-P10期間核小體在VSMC標記基因的佔有率。隨著H2A.Z佔有率的減少，核小體在VSMC標記基因的佔有率顯著增加（圖4A和4B）。此外，H2A.Z沉默顯著增加了VSMC標記基因的核小體信號（圖4C）。在全局範圍內，H2A.Z KD特異性的增強H2A.Z.抑制基因而不是H2A.Z激活基因上的核小體信號，表明從H2A.Z的存在降低了核小體佔有率以促進基因表達（圖4D和4E）。

　　圖4.H2A.Z降低VSMC標記基因的核小體佔有率

　　結果5-H2A.Z促進SMAD3向VSMC標記基因的募集

　　基於前人的研究，假設H2A.Z可通過促進募集SMAD3和SRF等因子來激活VSMC標記基因的表達。與此假設一致，H2A.Z佔據啟動子近端區域與SMAD3和SRF密切相關（圖5B）。通過對H2A.Z KD材料進行ChIP-Seq來驗證H2A.Z是否需要募集這些因子來行使功能。結果表明SMAD3與VSMC結合，標記基因明顯受損，而SRF結合不受影響（圖5C）。圖（5D-5J）與具有相對低的H2A.Z佔有率的區域相比，較高的H2A.Z佔有率區域SMAD3結合位點受到的影響更深刻；此外，在H2A.Z KD下調的基因附近，SMAD3結合減少，而在其他基因附近不變。總之，H2A.Z優先促進對維持VSMC特性的SMAD3進行募集。

　　圖5. H2A.Z促進SMAD3向VSMC標記基因的募集

　　結果6-H2A.Z促進MED1佔據VSMC標記基因

　　MED1是參與轉錄調控機制的重要成員，其佔有率對確定細胞特性至關重要。ChIP-Seq結果表明，H2A.Z佔用率與MED1結合呈正相關（圖6A）。此外，H2A.Z的耗竭削弱了MED1在VSMC標記基因上的募集（圖6B）進一步研究發現，在整體水平上，較高的H2A.Z佔有率對MED1結合基因的影響更明顯（圖6C和6D）。H2A.Z耗竭降低了MED1與H2A.Z.KD抑制基因的結合，而不是其他的基因；表明H2A.Z是促進MED1在VSMC標記基因上的募集並促進其表達（圖6E-6G）。

　　圖6. H2A.Z促進MED1佔據VSMC標記基因

　　結果7-過表達H2A.Z可減輕由損傷誘導的VSMC去分化和內膜形成

　　上文描述了H2A.Z在激活VSMC特異基因表達中的重要作用，存在一個疑問H2A.Z是否介導VSMC表型轉化和病理過程？基於這個問題作者分別在有無PDGF-BB的環境下培養過表達H2A.Z的VSMCs，VSMC標記基因的表達情況見圖7A。在對於小鼠構建的頸動脈損傷模型研究發現：在損傷後2周，H2A.Z的表達急劇減少，與人動脈病變組織研究結果一致（圖7B）。有趣的是，在損傷的動脈過表達H2A.Z，VSMC標記基因在mRNA和蛋白的表達水平均顯著提升（圖7B和7C）。此外，H2A.Z的過表達強烈抑制新生內膜形成，而膜的面積沒有受到顯著影響（圖7D、7E）。總而言之，H2A.Z在促進VSMCs的細胞特異性基因表達起到的重要作用，可作為血管疾病治療中一個潛在的可逆靶點（圖7F）。

　　圖7.過表達H2A.Z可減輕由損傷誘導的VSMC去分化和內膜形成

　　本研究的一大亮點是在單細胞水平研究病變組織，避免了研究病變組織樣本將異質性信息掩蓋的現象，新穎的高通量單細胞分選平臺WaferGen ICELL8對獲得具有活性的單細胞做出巨大的貢獻。下面我們認識一下這「功臣」（見圖8）。MultiSample NanoDispenser被比作 「靈巧的雙手」；Imaging Station被比作「銳利的眼睛」；Cellselect Software被比作「聰明的大腦」，三者的協調配合，將平臺優勢淋漓盡致的體現出來：

　　強大

　　最多可以分離1800個單細

　　快速加液和成像，實現通量最大化

　　實現細胞無偏向分離

　　靈活

　　單次可處理多至8個樣本

　　分析感興趣的細胞實現實驗效率的最大化

　　洞察：

　　先進的成像軟體篩選所需的（活的單細胞）

　　微分基因是美國WaferGen ICELL8高通量單細胞分選平臺在中國的唯一代理商，我們提供利用該平臺在單細胞轉錄組水平上的研究。

　　圖8. ICELL8單細胞系統組成

　　好了，今天的單細胞轉錄組測序的文章就和大家分享到這裡了，現在是不是為WaferGen ICELL8單細胞捕獲分選平臺強大的功能深深吸引，瘋狂打call？如果您有單細胞研究需求，歡迎致電諮詢。微分基因是一家專業提供高通量測序服務的公司，可根據您的個性化需求，定製個性化的方案。

　　微分基因為國家大基因中心「基因檢測平臺」運營方，專注於高通量測序技術，公司憑藉國際領先的高通量測序平臺，依託獨具優勢的高通量基因測序和大數據挖掘技術，為各大高校、醫院、科研單位以及第三方健康管理服務平臺，提供專業的基因檢測和數據分析解讀服務。2017年，微分基因在國家大基因中心建成2133平方米的潔淨分子生物實驗室，公司科研團隊匯聚了一批國內外優秀的基因組學實驗和生物信息分析研究人員。

　　科技服務部依託公司先進的自動化建庫儀、高通量測序儀等實驗設備，提供多種測序服務；憑藉強大的科研團隊，為高校、科研院所等研究單位提供領先的生物信息分析服務。主營業務包括DNA測序、RNA測序、表觀組學測序、單細胞測序、ICELL8單細胞表達譜測序、晶片服務、三代全長轉錄組測序等。

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