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老頑童說
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晝夜更替，四季輪迴，身在地球村裡的每個人都逃不開自然的周期變化。常言道：日出而作，日落而息; 春爭日，夏爭時。自然周期變化不僅影響著人們的生活和勞作，更是對個體生理健康至關重要。然而如今，越來越多的年輕人想要「打破自然周期」，成了「熬夜君」。經常熬夜的你可能還不知道晝夜節律對生理健康到底有什麼影響。這一期，我們就來說一說晝夜節律與成體幹細胞衰老之間「錯綜複雜」的故事兒。本篇綜述是西班牙巴塞隆納生物醫學研究所Salvador Aznar Benitah團隊於2020年5月發表在Cell Stem Cell雜誌上，題為「Circadian Regulation of Adult Stem Cell Homeostasis and Aging」的文章，詳細介紹了成體幹細胞的晝夜節律調控機制，以及成體幹細胞衰老與晝夜節律調控之間的複雜關係。
通訊作者：Salvador Aznar Benitah
(圖片源於網絡)
摘要
晝夜節律能夠實時調控細胞的生理活動，預測每日環境的變化並及時抑制潛在的有害生理過程。通過在組織水平同步所有細胞，晝夜節律可以確保機體一致的時間生理特性。有關成體幹細胞生理特徵的最新研究表明，幹細胞衰老與晝夜節律紊亂緊密相關。本篇綜述討論了晝夜節律如何調節和同步化成體幹細胞的功能，以及衰老過程中晝夜節律變化調控成體幹細胞穩態的外在和內在機制。
引言
地球繞其軸心自轉形成了24小時的晝夜周期變化，造成了光照(白天和黑夜)、溫度、食物可獲得性和捕食者活動等的變化，地球上的各種生命個體也必然受到這些變化的影響。這些生命個體進而發展出了可以感受並適應時間變化的節律機制，這些機制遵循以下原則：（1）它們使生物體對一天內時間信號的變化作出響應，即所謂的環境鍾提示（Zeitgeber cues，Zeitgeber在德語中為「時間給予者（time giver）」的意思）；（2）它們能夠形成周期大約為24小時的晝夜節律振蕩（「circadian」源自拉丁文circa diem，「大約一天」的意思）；（3）即使在沒有外源晝夜變化的情況下，它們也能維持自我建立的晝夜節律振蕩，從而使它們能夠根據時間預測生物體的生理狀況。
哺乳動物晝夜節律時鐘由受轉錄/翻譯反饋迴路調控的複雜轉錄振蕩器網絡組成。晝夜節律轉錄因子(transcription factor, TF)複合物BMAL1(brain and muscle ARNT-like 1)/CLOCK(circadian locomotor output cycles kaput)可以結合E-box元件以激活時鐘控制基因(clock-controlled genes，CCGs)的轉錄。CCGs包括period (Per)和cryptochrome (Cry)，它們的蛋白質產物會反過來抑制BMAL1/CLOCK的轉錄活性（包括其自身的轉錄）。PER和CRY經蛋白酶體降解會解除對BMAL1/CLOCK複合物的抑制作用，觸發新一輪的轉錄周期。此外，BMAL1/CLOCK可以從轉錄水平促進核受體亞家族1 D組成員1(nuclear receptor subfamily 1 group D member 1, Nr1d1或REV-ERBα)、成員2(Nr1d2或REV-ERBβ)以及視黃酸受體相關的孤兒受體(Retinoic Acid Receptor-related orphan receptor, RAR-ROR)家族的表達。REV-ERBα和REV-ERBβ能夠抑制Bmal1的表達，而RORs能夠激活Bmal1表達，因此REV-ERBα/β會與RAR-ROR競爭共享的DNA結合位點(此位點稱為ROREs)，進一步調節BMAL1/CLOCK複合物以及CCGs。與其他晝夜節律控制的TF(如D-box binding Protein Albumin Receptor Basic Leucine Zipper Domain TF，DBP)一起，晝夜節律時鐘網絡建立了CCGs的轉錄振蕩(圖1)。
圖1.晝夜節律與衰老相關的信號通路之間的分子網絡連接
BMAL1和CLOCK構成了節律生物鐘的核心TF複合體。許多正反饋和負反饋迴路（如：PER、CRY、REV-ERB和ROR蛋白）建立了生物鐘的晝夜節律性。且多個衰老相關的信號通路與生物鐘緊密相關，如：營養感應途徑(涉及mTOR、SIRT1和AMPK)、機械感應、TFs(HIF1α)。(黃色：節律生物鐘的核心激活信號複合體；紅色：BMAL1/CLOCK的負調節器；綠色：BMAL1/CLOCK正調節器；紫色：將衰老相關信號和晝夜節律調節聯繫起來的蛋白質。)
核心的節律機制能夠在哺乳動物的大多數細胞中表達，並在除睪丸和胸腺外的所有周圍組織中產生晝夜節律的轉錄振蕩。通過同步化組織內所有細胞的時相狀態，能夠形成組織水平上的晝夜節律輸出，這一過程稱為「協同(entrainment)」。視網膜感知的環境光是主要的協同信號。這種光信號重置了下丘腦神經元簇(即視交叉上核，suprachiasmatic nucleus，SCN)的晝夜節律相位，後者又將信號傳輸到外周組織，並被作為中央時鐘或起搏器。因此，損傷SCN會破壞節律性運動、節律性進食和飲水以及內分泌節律等。SCN為生物提供了晝夜節律的自主權，即能夠預測而不只是響應周圍環境變化的能力。特別是，通過整合直接信號(如體液信號和自主神經系統傳導的神經信號)以及間接信號(如節律性靜息活動、體溫、氧氣水平、進食周期等)，它能夠在恆定的黑暗條件下維持周圍組織的晝夜節律同步。組織對不同的SCN依賴性協同線索具有不同的敏感性和動力學。此外，小鼠模型體內實驗表明，當SCN受到解剖損傷、功能性遺傳破壞後，或除SCN以外的任一組織中沒有生物鐘的情況下，某些組織仍能保持晝夜時鐘同步(儘管振蕩幅度較低)。因此，外周組織的晝夜節律協同可能不僅需要從SCN衍生的顯性信號，而且還需要利用來自外周組織的系統性信號進行微調。
受核心生物鐘轉錄機制特定的表觀遺傳背景以及譜系特異TF差異的影響，外周組織在同步時表現出高度組織特異性的晝夜節律輸出。轉錄後和翻譯後調節機制也有助於建立節律性基因表達，即使在轉錄水平沒有節律變化的情況下。因此，晝夜節律性變化發生在多個調節層，包括轉錄組、蛋白質組、代謝組乃至微生物組。
成體幹細胞的晝夜節律及其微環境
成體幹細胞(stem cells，SCs)是能夠自我更新，產生特殊細胞類型的多能細胞。在這裡，作者總結了部分成體SC組分的晝夜節律性生理變化，以及晝夜節律在調節SC穩態和衰老中的意義。
造血幹細胞
造血幹細胞(Hematopoietic SCs，HSCs)能夠產生所有的血細胞譜系細胞，在穩態條件下處於靜息狀態，而其後代細胞，造血幹/祖細胞(hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs)則負責維持造血過程中新細胞的高生成率。骨髓HSCs能夠表達核心時鐘機制的基因，但是，其核心時鐘基因的轉錄振蕩似乎基本不存在。
HSCs和HSPCs在靜息階段首先從骨髓進入循環系統(如小鼠和人)，而後回到骨髓中。從機制上講，其外出和返回取決於多個因素。首先，在骨髓中C-X-C基序趨化因子配體12(C-X-C motif chemokine ligand 12，CXCL12)的梯度表達能夠作為表達C-X-C基序趨化因子受體4(C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4)的HSCs的駐留信號。該機制依賴於由骨髓中交感神經系統(sympathetic nervous system，SNS)神經元釋放的局部去甲腎上腺素激活的晝夜節律性β-腎上腺素信號，β-腎上腺素信號能夠激活基質細胞中的SP1，從而導致CXCL12的節律性表達。HSPCs表面CXCR4的水平變化由核心晝夜節律機制控制。在循環系統中，中性粒細胞經歷一系列衰老過程，這一過程受晝夜節律調節，老年中性粒細胞被骨髓中的巨噬細胞吞噬，從而促進HSPC進入循環系統。
其次，應激激素皮質酮的生理性晝夜節律振蕩通過CXCL12和Notch1信號調節HSC/HSPC的增殖和遷移。然而，HSPC內在的節律似乎並沒有增強HSPCs的增殖和分化潛能。相反，光亮和黑暗的周期確實能夠通過HSPCs內部的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)和去甲腎上腺素介導的代謝改變來調節HSPC的自我更新和分化。因此，儘管晝夜節律時鐘網絡對於HSPC進入循環系統並回到骨髓的每日周期變化至關重要，但晝夜節律時鐘與HSPCs穩態和功能之間的相關性仍是難以捉摸的。
表1 年輕與衰老乾細胞的晝夜節律時鐘和晝夜節律功能
本表格總結了晝夜節律的功能以及年輕與衰老乾細胞中生物鐘失衡的後果。
濾泡間表皮幹細胞
濾泡間表皮幹細胞（epidermal stem cells，EpSCs）擁有很強的自我更新和分化能力，以維持表皮組織的屏障功能。小鼠體內的EpSC，以及體外培養的人角質形成細胞都會發生核心時鐘機制的振蕩。同時細胞周期調控是濾泡間EpSCs最突出的循環調節功能之一，其中，處於S期的小鼠基底細胞百分比的最高峰在夜間出現。
表皮會經常暴露在有害因素中，比如紫外輻射、感染等。而為了保證機體在特定時間段內免受紫外線損傷，小鼠中的許多同DNA損傷修復相關的基因都會發生晝夜節律性的表達，不過，Bmal1敲除小鼠喪失了這種能力。此外，當DNA修復基因（如jetlag）處於低表達狀態時，高強度的紫外線會顯著性地增加皮膚DNA損傷，並易於發展為紫外線輻射介導的皮膚癌。
同樣地，表皮和EpSC中許多代謝相關基因的表達也受到生物鐘的控制。比如，從小鼠EpSC中NAD+與NADH的比率變化中便可窺得一二，氧化磷酸化水平在日間達到峰值，而糖酵解的峰值出現在夜間（小鼠常在夜間活動），但這些現象依賴於BMAL1的表達。值得注意的是，氧化磷酸化比率的增加同活性氧水平升高以及S期的基底表皮細胞減少是密切相關的。這種從氧化磷酸化到糖酵解的晝夜節律轉變可能使EpSC根據時間將DNA複製與氧化磷酸化的峰值狀態，以及紫外線的高暴露階段劃分開，從而降低二者對DNA複製的有害影響。
毛囊幹細胞
毛囊經歷著反覆循環的生長、靜息和退化階段，其中位於隆突區的毛囊幹細胞（hair folliclel stem cells，HFSCs）主導著這一生物過程。儘管頭髮的生長周期要遠大於24小時，但HFSC也是處於晝夜節律的調控之下的。例如，隨著全身晝夜節律紊亂的小鼠慢慢長大，其毛囊生長期處於停滯狀態。這很可能是由於Bmal1缺失引起的外界調控信號或年齡相關的損傷積累所致，因為毛囊周期循環在條件性敲除表皮Bmal1的年輕小鼠中是正常的。但是，年輕小鼠表皮的強迫性晝夜節律失衡會干擾HFSC和祖細胞中DNA複製的晝夜節律。這使得毛囊對遺傳毒性應激的敏感性呈周期性變化，早晨受損風險增加，而晚上則較低。
有趣的是，核心時鐘機制的成分在毛囊祖細胞中同質表達，而在膨大的HFSC（人和小鼠中）中卻是非完整性表達的。這種不完整的表達與膨大HFSC對增殖分化調控信號的敏感性相關，這表明生物鐘代表著HFSC不同的狀態，並且這些狀態對於增殖分化信號有著不同的響應傾向。
腸道上皮幹細胞
Lgr5+腸道上皮幹細胞（intestinal epithelial stem cells，IESCs）位於隱窩基底部，隱窩較底層的轉運-擴增細胞室為分化的組織細胞補充日常所需能量。Lgr5+IESCs散布在終末分化的分泌細胞（稱作Paneth細胞）間，這些分泌細胞可以為IESCs提供養分，也是幹細胞微環境的重要組成部分。
生物鐘也控制著腸道的一些基本生理功能，例如組織再生、上皮-微生物群通訊、腸道通透性、應對感染和炎症反應的免疫響應以及身體構成。令人意外的是，體外培養的腸道3D類器官在沒有外部同步信號調控下，也發生了同步的晝夜節律變化，非分裂細胞表現出強烈的晝夜節律轉錄周期，而IESC與祖細胞中的Per2報告基因僅發生微弱的轉錄振蕩。在IESC中，Paneth細胞生物鐘通過細胞間的WNT信號控制細胞分裂。因此，細胞間的偶聯（通過分泌因子）不僅會使類器官內不同細胞之間以及不同類器官之間的生物鐘轉錄振蕩同步，可能還會使SCs和祖細胞中的細胞分裂周期同步。
不過，仍然還存在著一些爭議問題，比如IESC是否缺少功能性的生物鐘「發條裝置」，或者與之相反，體內穩態下IESC是否擁有增殖性節律？儘管如此，在應對輻射的再生反應中，腸道上皮細胞增殖是符合Bmal1依賴性的晝夜節律周期變化的。然而由於體外對細胞增殖周期與體內對內在穩態與再生條件的不同調控，其結果不盡相同。比較有意思的是，果蠅IESC的核心時鐘成分也存在著轉錄振蕩，這似乎取決於與微環境的信號交流。
神經幹細胞
不同類型的相對靜息神經幹/祖細胞（neural stem and progenitor cells，NSPCs）位於不同的大腦區域（包括海馬齒狀回[DG]的亞顆粒區[SGZ]和緊鄰側腦室的前腦室下帶[SVZ]），其時鐘基因的晝夜節律行為會有些不同。比如，小鼠SGZ內的一些核心時鐘蛋白會在靜息態NSPC中發生振蕩，而在增殖期的NSPC（神經發生過程）中停止，並在神經元成熟後再次擁有晝夜節律性。此外，在取自SVZ或DG的神經幹細胞的神經球培養物中，Per1報告基因僅在分化時出現穩定的晝夜節律變化。這表明在不同的SC階段，時鐘的功能可能有所不同。最後，NSPC增殖期間的晝夜節律僅發生在大腦的某些區域，並非全部。比如，儘管SGZ和SVZ中的脫氧尿苷陽性NSPC在S期中並不同步，但在DG中可觀察到M期NSPC的晝夜節律變化，這表明NSPC的有絲分裂也受生物鐘的調控。
儘管目前對NSPC內在的生物鐘轉錄輸出和生理相關性知之甚少，但已經發現一些核心時鐘基因可以調控神經的發生。例如，BMAL1缺失會促進年輕小鼠NSPC的增殖，並導致生命後期的幹細胞衰竭。此外，在時差反應期間，晝夜節律與外部環境的不平行會抑制神經的發生。不過，尚有幾個問題有待解決，包括時差介導的神經發生抑制是否依賴於NSPC生物鐘，以及微環境的晝夜節律信號與NSPC內在「時鐘發條「的信號對神經發生與NSPC生理狀態有何影響。值得注意的是，NSPC微環境中的多種神經遞質和糖皮質激素（如，皮質醇、多巴胺、5-羥色胺、γ-氨基丁酸和穀氨酸）發生晝夜節律相關的濃度變化。因此，微環境中的生物鐘似乎也影響著神經幹細胞的生理狀態。
骨骼肌幹細胞
骨骼肌幹細胞（也稱作衛星細胞）是與肌纖維緊密相關的長期靜止細胞，它主要在損傷刺激時活化。衛星細胞在體內會發生核心時鐘機制的強烈振蕩。重要的是，晝夜節律的輸出涉及衛星細胞穩態所需的途徑，例如那些調節靜息態、活化準備（比如轉化生長因子β/骨形態發生蛋白和成纖維細胞生長因子信號）、細胞骨架以及自噬的信號通路。
BMAL1也與肌肉發生和衛星細胞維持有關。不過和神經發生以及EpSCs不一樣的是，BMAL1缺失不能促進WNT信號下遊調控的成肌細胞分化。此外，BMAL1似乎可以直接或間接調節MyoD的表達，MyoD是肌肉生成的關鍵調控者，導致Bmal1基因敲除小鼠骨骼肌的肌絲結構受到損傷。
總而言之，生物鐘可能是通過控制衛星細胞的靜止與活化準備沿著適當的時間軸發生，從而影響衛星細胞的生理狀態與維持。
成體幹細胞微環境中的晝夜節律系統信號
成體幹細胞可以接收來自局部微環境或系統的提示信號，包括神經、體液和代謝信號，從而受到生物鐘網絡的調控。接下來，將簡要總結一下那些可能調控成體SC功能的晝夜節律系統信號。
依賴SCN的自主神經信號可以調節腎上腺功能，並影響糖皮質激素的分泌。重要的是，依賴SCN的神經信號傳導同多種成體幹細胞的微環境相關，比如毛囊和HSC室。因此，自主信號可以調節成體幹細胞生物鐘與生理狀態。
生物鐘網絡控制著多種激素，包括褪黑激素和糖皮質激素，這些激素有助於同步化外周組織的生物鐘。同局部外周組織的生物鐘相一致，SCN通過松果體調節褪黑激素水平以及通過下丘腦垂體腎上腺軸調控糖皮質激素（例如皮質醇）的水平。褪黑激素將環境中光亮的變化信號傳遞給周圍組織的生物鐘，從而調節睡眠狀態，並影響血管反應性並充當抗氧化劑。有趣的是，褪黑激素可以影響神經幹細胞的增殖和分化，並調節間充質SC的分化。
糖皮質激素對於機體的應激反應非常重要。糖皮質激素水平基線呈現出晝夜節律變化，並在生物體的活動階段達到最大水平。糖皮質激素通過轉錄和非轉錄途徑發揮作用，可以影響能量代謝、脂質代謝以及炎症。糖皮質激素信號傳導牽涉到多種組織的SC和祖細胞增殖，例如，小腸、肺和表皮。值得注意的是，糖皮質激素的晝夜節律同海馬區DG的神經SC激活以及靜息態神經SC庫的維持相關。
大多數代謝途徑會受到生物鐘網絡的控制。最新的代謝組學研究表明，生物鐘網絡不僅讓許多代謝物發生晝夜節律振蕩，而且有助於按照時間軸協調不同器官間的組織內在代謝組。尤為重要的是，高脂飲食和飲食限制會改變成體SC以及整個器官水平的晝夜節律相關的轉錄輸出。因此，生物鐘網絡控制著局部和全身的新陳代謝水平，並影響成體SC的生理狀態。
成體幹細胞的衰老過程與晝夜節律
在衰老過程中，成體SC數目和功能的減退會導致再生能力下降，並引起組織穩態的失衡。生物鐘和晝夜節律不僅同成體SC穩態有關，而且還與其他一些誘發衰老的過程交織在一起，例如表觀遺傳調控、營養感應、線粒體功能和細胞間通訊。幾種衰老的標誌物反過來也能影響生物鐘的正常運轉。在哺乳動物中，生物鐘紊亂會增加罹患多種疾病的可能性，縮短壽命期，比如癌症。此外，人為誘發的慢性「時差反應」可以增加小鼠的死亡率。文章在這裡討論了衰老相關的晝夜節律功能改變是如何負面影響成體SC功能並促進衰老的。
衰老的系統生物鐘網絡
隨著衰老進程，SCN在同步化外圍組織時鐘中的主導作用受到多種影響。例如，由於晶狀體透光率降低，即將光信號傳遞給SCN的固有感光視網膜神經節細胞數量減少，老年動物對光的捕獲和響應靈敏度降低，並且SCN本身也發生了功能減退。SCN中的總細胞數似乎隨著年齡的增長而不變。不過，小鼠和人類中的老化SCN中表達神經遞質血管活性腸多肽（vasoactive intestinal polypeptide，VIP）的神經元較少，其中VIP是SCN神經元之間細胞偶聯的重要介體。老化的SCNs還會表現出神經元間的胞間偶聯以及突觸末端數量減少。因此，光輸入敏感性、信號傳遞以及神經網絡內的細胞偶聯的不斷降低會導致衰老SCN光反應性的減退。很顯然，衰老SCN的功能退化會極大地縮短壽命，而將SCN從年輕供體移植到老年倉鼠受體中，可將其壽命延長近20％。
衰老以基因特異性的方式影響SCN中核心時鐘基因的表達。例如，儘管在衰老SCN中，Bmal1和Per2的總蛋白水平降低，但其他時鐘基因的表達或周期延長並未發生變化，不過老年SCN神經元內信號的晝夜節律幅度會降低。儘管尚不清楚這些明顯變化的功能相關性，但它們很有可能會導致衰老相關的SCN依賴的晝夜節律輸出減少，比如運動幅度降低和光周期適應性降低、睡眠-覺醒周期減少、體溫循環減慢、神經活動節律和體液節律受損。
幹細胞微環境與系統信號中的衰老與晝夜節律
幹細胞微環境中的一些衰老相關的變化是受生物鐘網絡調節的，或影響微環境中的生物鐘節律。衰老的ASC微環境中的神經信號可能受到損壞，衰老外周組織中對去甲腎上腺素能刺激與腎上腺素能受體mRNA表達下調的反應變弱。老年小鼠血液中的HSPC水平的晝夜節律振蕩喪失以及SPC衰老依賴於HSPC微環境的交感神經支配和β-腎上腺素能信號的減少，不過HSPC衰老是否也依賴於SCN的晝夜節律對於交感神經的控制力減弱，還有待證實。
此外，HFSCs的光依賴性活化取決於SCN控制的交感神經支配和皮膚中去甲腎上腺素的釋放，但似乎與SCN介導的身體活動節律變化無關。因此，衰老相關的SCN功能下降和SCN下遊信號傳輸受損可能是通過HFSC微環境中的晝夜節律來促進HFSC的衰老。
據報導，褪黑激素和糖皮質激素（例如皮質醇）的晝夜節律振蕩隨著年齡的增長而衰減。但是，這可能只發生在人類的非健康衰老過程中。褪黑激素不僅是晝夜節律系統中主要的同步因子，而且具有顯著的延緩衰老特性。將幼鼠松果體移植到老年鼠中，可以延長其壽命。並且褪黑激素可以調節抗氧化酶的表達與活性，是一種自由基清除劑。褪黑激素還能夠促進造血功能，保護造血系統免受自由基、輻射誘發的損傷與細胞毒性藥物的損害；並保護培養的HSPC免受化學療法的毒性。最後，褪黑激素補充劑可以促進老年小鼠和體內脊髓損傷後的神經發生，並促使體外NSPC的增殖和分化。
老年大鼠體內糖皮質激素水平的升高與海馬神經發生減退，以及衰老相關的記憶障礙相關。糖皮質激素的生物鐘振蕩則同海馬區幹細胞群體的保存相關。然而，激素信號的晝夜節律振蕩是否以及如何影響衰老SC微環境仍有待確定。
除了改變晝夜節律對系統因素的控制外，衰老相關的局部變化也可能對ASC功能產生負面影響。例如，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）硬度的機械敏感性可以調控乳腺上皮SC，表皮角質形成細胞和肺上皮細胞中生物鐘的振蕩幅度。由於乳腺組織中的ECM硬度會隨著年齡的增長而增加，因此在取自老年小鼠的組織外植體中，乳腺上皮細胞的晝夜節律振蕩幅度會降低。不過，這一現象是否也存在於體內還尚待證實。
此外，由晝夜節律時鐘在局部微環境中細胞產生的信號可能會影響ASC生理的時間軸結構。據報導，小鼠大腦非SCN區域中的某些核心時鐘蛋白（如BMAL1、CLOCK）的振蕩（主要是振幅，也有相位）會隨著年齡的變化而變化，以及在肝臟和胰腺中的RNA水平也會發生衰老相關的改變。然而，令人意外的是，許多衰老組織的核心晝夜節律機制的振蕩幾乎沒有發生變化，比如肝臟、心臟、松果體、下丘腦的室旁核、肺、結腸、腎臟、下頜下腺、表皮以及毛囊。因此，至少在大多數非應激條件下的外周組織中，生物鐘在衰老過程中似乎相對穩定。然而，當受到光的相移這一刺激時，同年輕大鼠相比，老年PER1 :: LUC報告基因大鼠的肝臟外植體相位重置反應發生改變。不過，這一發現並未在年輕與衰老SCN外植體得到重複。因此，光相位的變化可能會使老年個體不同組織間的生物鐘失調。值得注意的是，在缺少同步光信號的情況下採集組織，一些源自老年個體的外周組織（如腎臟，肝臟和下頜下腺）的外植體表現出PER2 ::-LUC報告子振蕩的相移。這些結果表明，衰老降低了生物鐘網絡在組織水平上對於環境信號動態變化的響應能力。
成體幹細胞的衰老與晝夜節律
最近的一項研究揭示了一個懸而未決的科學問題，即在體內生理衰老過程中，ASC的生物鐘是如何發揮作用的。有趣的是，在衰老的EpSCs和骨骼肌衛星細胞中，核心晝夜節律仍然保持完美的節奏。然而，在衰老的EpSCs和衛星細胞中只有一小部分CCGs在轉錄水平維持每日振蕩，一些新的基因集則每日節律表達。在衰老的小鼠肝臟、人類前額皮質和果蠅的頭部中也具有這一重編程的晝夜節律轉錄組。因此，這些研究建立了轉錄組的晝夜節律重編程作為在組織和ASC水平上衰老如何影響生物鐘功能的新範式（圖2）。這種與衰老相關的晝夜節律重編程的核心是在迄今為止研究的所有衰老組織和幹細胞中觀察到的，新的振蕩節律輸出總是與組織特有的壓力有關。
圖2.影響成體幹細胞晝夜節律性的衰老相關變化
光透過率降低和固有的感光性視網膜神經節細胞（IpRGC）變性減少了對SCN的光輸入信號。SCN的功能衰退進一步削弱了SCN的輸出，包括較弱的睡眠-覺醒周期，代謝周期的改變，以及神經和體液輸出的減少。在衰老的外周組織和ASC隔室中，同步信號的傳遞不那麼有效，這是由於整體體力活動減少，ASC微環境的神經支配減少以及機械特性改變所致。雖然核心節律似乎在大多數衰老的外周組織中保持相當強勁的振蕩，但同步提示的穩健性降低可能會降低外周組織對環境條件變化的反應能力。最後，老年小鼠成年幹細胞的晝夜節律轉錄組的重新編程和晝夜節律性的改變也可能依賴於微環境相關線索的改變。
EpSCs是高度增殖的，並且主要在夜間複製其DNA，此時氧化磷酸化誘導的遺傳毒性應激較低。與此一致，成年小鼠EpSCs中的振蕩轉錄本在很大程度上參與了穩態功能，如DNA複製、分化和屏障功能。另一方面，老齡小鼠的EpSCs進入S期的時間延遲約8-12h，與氧化磷酸化達到最大值的時間一致。因此，在老年的EpSCs中，結構鬆散的DNA可能暴露在更高水平的基因毒性應激下，這可能是他們DNA氧化水平升高的原因之一。因此，衰老小鼠的EpSCs的振蕩轉錄組與DNA修復、ROS反應和炎症過程有關。
與EpSCs不同的是，骨骼肌中的衛星細胞通常處於靜止狀態，因此不會經歷複製壓力。然而，許多參與調節衛星細胞靜止功能的轉錄本，如肌管分化或TGF-β/BMP和FGF信號，在成年小鼠的衛星細胞中振蕩。老化的衛星細胞仍保持靜止，並保持轉錄本的節律性，這些轉錄本參與調節它們與微環境間的相互作用。然而，老年小鼠衛星細胞中新的振蕩轉錄本涉及炎症和線粒體DNA修復的調節。重要的是，老化的衛星細胞顯示出整體自噬水平的下降，參與自噬調節的轉錄本失去有節律的表達。
綜上所述，衰老導致的ASC重編程的節律性輸出，反映了單個幹細胞區室內與衰老相關的特定組織條件。此外，在衰老的幹細胞中，全身性或微環境相關的信號發生變化，這可能有助於與衰老相關的晝夜轉錄組的重編程。另外有報導顯示，卡路裡限制在很大程度上阻止了與衰老相關的晝夜節律重編程，這一發現進一步支持了此觀點，同時，卡路裡限制也限制了SCN的節律。
晝夜節律紊亂與成體幹細胞衰老
在基因操縱的動物模型中，晝夜節律的破壞與衰老過程中部分組織和ASC區室的病理狀況的發展有關。例如，PER2是衰老相關DNA損傷反應的負調控因子，特別是在偏向於淋巴的HSPC中；與野生型小鼠相比，Per2缺陷小鼠在DNA損傷反應中沒有表現出造血幹細胞分化缺陷，這可能有助於延長壽命。
全身Bmal1敲除和表皮特異性BMAL1缺乏導致分化的角質形成細胞數量的增加和類似衰老的表型。全身Bmal1 敲除小鼠的EpSCs表達更高水平的分化標記，在僅表皮表達BMAL1的小鼠中，這些分化標記部分恢復到野生型表達模式。因此，表皮固有的和非表皮的BMAL1都能阻止EPSCs的分化增加。有趣的是，與全身Bmal1 敲除小鼠相比，在完全黑暗中保持1周，僅表皮表達BMAL1的小鼠失去了表皮晝夜節律轉錄周期，但分化標誌物在很大程度上保持表達減少。因此，BMAL1可能阻止EPSC分化，至少部分獨立於其在生物鐘中的功能。值得注意的是，Bmal1 敲除小鼠的表皮在受傷後傷口癒合的能力也降低。此外，去除毛囊中的BMAL1會導致老年小鼠中標籤保留突起幹細胞水平的增加和增殖細胞數量的減少，而Per1/Per2缺陷具有相反的表型。這表明生物鐘決定了EpSC在整個衰老過程中的激活和維持。
中年Bmal1 敲除小鼠的衛星細胞數量減少，但在成年誘導肌肉特異性BMAL1缺失的小鼠中沒有減少，這表明骨骼肌外源性BMAL1是調節衛星細胞水平所必需的，和/或BMAL1對衛星細胞維持的調節是在早期發育階段確定的。與此相一致，Bmal1 敲除小鼠損傷後通過衛星細胞擴增的再生受到了損害。有趣的是，REV-ERBα（一種Bmal1基因轉錄抑制劑）對肌肉生成的影響與BMAL1相反，它通過抑制增殖和分化來抑制成肌細胞的肌生成；此外，Rev-ERBα的丟失通過增加損傷後增殖的衛星細胞擴張來促進肌肉再生。REV-ERBα還調節WNT信號和其他參與SC增殖的途徑。BMAL1和REV-ERBα缺乏對衛星細胞數量的相反作用表明它們是通過它們在生物鐘中相反的功能來調節衛星細胞的維持。
研究發現，幾個核心節律基因與神經形成有關。Bmal1敲除小鼠在5-6周齡時神經形成增加，8周齡NSPC增殖沒有變化，10-15周齡DG中NSPC增殖減少，這表明BMAL1是防止成年小鼠在年輕時和SC耗竭後NSPC過度增殖所必需的。值得注意的是，腦特異性Bmal1耗竭會引起神經病理學變化，小幹擾RNA（siRNA）介導的體外神經球培養中Bmal1敲低會改變神經分化，表明BMAL1調節NSPCs或局部環境中的神經發生。此外，BMAL1促進NSPCs的遷移行為，並防止NSPC中ROS水平的增加。與Bmal1 敲除小鼠相似，Per2 敲除小鼠表現出神經形成增加，並且增殖型1型神經前體細胞數量增加；然而，只有Bmal1 敲除小鼠包含更多的增殖型2b型神經前體細胞、有絲分裂後3型神經前體細胞和SGZ中的新神經元。因此，PER2和BMAL1阻止了大量原本靜息的NSPCs進入細胞周期，但只有Bmal1缺乏才會進一步促進更多的NSPC退出細胞周期，並在SGZ產生新的神經元。研究發現，在Rev-erbα 敲除小鼠中增殖性NSPCs的數量也有所增加，而Cry1/Cry2雙敲除小鼠DG和SVZ衍生的神經球數量的減少。儘管Bmal1 敲除、Per2 敲除和Rev-erbα 敲除小鼠在神經發生中缺乏晝夜節律性，但很難將這些缺陷歸因於節律中耗盡的基因的功能。由於NSPCs中是否存在振蕩的生物鐘仍然存在爭議，因此不能排除一些觀察到的與節律無關或依賴於微環境線索的表型。此外，Bmal1或Rev-erbα缺乏會導致NSPC增殖增加，而Rev-Erba是BMAL1表達的負調節因子。因此，可以想像，不同的時鐘相關基因可能會以一種獨立於它們在生物鐘中的作用方式影響神經形成，並通過不同的機制手段，即使NSPC增殖增加結果是相同的。
綜上所述，核心節律基因在幾種組織中的ASC池的衰老過程中起著重要的維持作用。一般來說，雖然BMAL1似乎通過減少年輕時的增殖來防止SC耗竭（HFSCs除外），但BMAL1在生物鐘中的負調控經常（但不總是）具有相反的功能。因此，可能晝夜節律核心時鐘的基因不僅通過節律相關的機制，而且通過非節律相關的功能來調節ASC的生理機能。生物鐘基因調控的中斷對ASC的生理影響具有組織特異性，這些效應可歸結為細胞周期（Mis）調節、與分化和增殖相關的SC信號通路的調節以及細胞損傷的增加，這些機制如何在ASCs的整個衰老過程中起作用還需要進一步的研究。
調節晝夜節律的衰老相關信號通路
參與調節衰老過程的三條信號通路：哺乳動物雷帕黴素靶標（mTOR）信號、sirtuin依賴的信號和單磷酸腺苷活化的蛋白激酶(AMPK)信號，被認為與調節時鐘功能有關。
煙醯胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）依賴的脫醯基酶SIRT1通過使PER2和BMAL1脫乙醯化而在核心節律水平上調節生物鐘功能，並通過在CCGs的啟動子處使組蛋白H3脫乙醯化而在輸出水平上調節時鐘功能。SCN中BMAL1和PER2表達的隨年齡降低(導致SCN的晝夜節律功能下降)是依賴於SIRT1。Bmal1反過來調節限速酶煙醯胺磷酸核糖轉移酶（NAMPT）在NAD+補救途徑中的表達，導致SIRT1活性的晝夜調節。重要的是，SIRT1活性及其輔因子NAD+水平隨著年齡的增長而降低，兩者都與ASCs的衰老過程有關。
mTOR信號通過影響營養感知、蛋白穩態的維持、自噬、線粒體功能障礙、細胞衰老和ASC功能來調節衰老過程。mTOR調節SCN中細胞間耦合因子VIP的翻譯，影響SCN進入轉換的光/暗周期的能力。此外，mTOR信號組件核糖體蛋白S6激酶β1（S6K1）磷酸化BMAL1，導致BMAL1與翻譯機制的節律性關聯。mTOR信號還控制BMAL1蛋白穩定和外周組織中生物節律的周期長度。有趣的是，Bmal1缺乏增加了mTOR信號，而抑制mTOR信號延長了短暫Bmal1缺陷小鼠的壽命，論證了mTOR相關信號和BMAL1之間的雙向關係。
AMPK作為細胞低能狀態的傳感器，可以激活幾個與衰老相關的通路，包括mTOR和sirtuin通路。AMPK可以直接促進CRY的降解，並且通過酪蛋白激酶Iε（CKIε）激活PER降解，直接影響生物鐘的調節。
此外，衰老相關的代謝改變可能影響SCs的節律功能。例如，多胺調節節律成分之間的相互作用。多胺水平隨著年齡的增長而下降，導致持續黑暗中的晝夜節律期延長。此外，鑑於HIF1a在介導氧依賴節律復位和調節晝夜轉錄中的作用，HIF1a在老年組織中的積累可能會影響生物節律的功能。
未來展望
對晝夜節律的研究進展闡明了晝夜節律對SC功能的重要性，並表明晝夜節律對ASC生理的時間組織對於維持組織和SC的動態平衡是至關重要的。轉錄/翻譯振蕩器系統和晝夜節律輸出似乎適應年輕生物體中每個ASC區室的特定穩態需求；相反，在老年ASCs中，晝夜節律功能轉向應激主導的程序。
似乎並不是所有的ASC都建立了核心節律機制的轉錄振蕩，即使生物節律成分在大多數SCs中都有表達。具體地說，胚胎幹細胞和一些ASC亞室，包括IESCs、HSCs，可能還有一些NSPC群體，不會建立核心發條的強大轉錄振蕩，而只在它們的分化過程中產生晝夜節律轉錄振蕩。造成這種差異的機制背景和生理原因目前仍不清楚。胚胎幹細胞（Embryonic stem cell，ESCs）和胎兒心臟中節律蛋白表達的轉錄後抑制與這些未分化細胞中缺乏生物節律功能有關，這種抑制的釋放可能與分化過程有關。有趣的是，在體外β細胞分化過程中誘導多能幹細胞的生物節律振蕩也會觸發表觀遺傳學變化，從而促進工程化胰島的成熟，這表明在幹細胞中建立功能節律可能是分化和成熟過程中的重要一步。亟需更多研究來揭示在不同的ASC間隔中是否有功能節律的生理意義，並確定哪些胞內或胞外信號決定節律功能和晝夜節律輸出。
然而，重要的是，即使在缺乏振蕩節律的SC群體中也觀察到每日的生理節律，這表明在這些細胞中，晝夜節律是由微環境、非轉錄信號建立的。研究者們在表皮中發現了一個與生物節律無關的節律性的例子，每天的光周期足以維持參與翻譯和氧化磷酸化調控的基因的每日轉錄振蕩。ASC的生理和衰老是否受到晝夜節律獨立於生物節律調節的影響仍有待確定。
在外周組織中，生物節律似乎起到了振蕩器的作用，允許上遊同步的環境信號-外部的（如光或食物攝取）和內在的（如代謝、溫度或機械線索）結合在一起，從而協調下遊的組織生理。在健康的年輕生物體中，同步信號的上遊信號傳遞不受幹擾會導致強勁的時鐘擺動。衰老過程中信號轉導的惡化，例如，通過減少自主神經支配、改變體液信號，以及增加ECM硬度，可能導致外周組織和ASCs中節律振蕩器的穩健性降低。這反過來可能會降低節律對環境條件下變化的反應能力，並可能導致不同外周組織和成體幹細胞之間有害的時鐘不同步。這裡還需要進一步的工作來澄清這些與衰老相關的幹擾的影響。
晝夜節律輸出對於ASC的動態平衡和正常的日常組織功能至關重要。至關重要的是，儘管幼鼠的生物節律輸出主要涉及特定組織或成體幹細胞區的穩態功能，但在老年鼠中，新的一組基因變得有節奏，通常涉及組織特異性的應激相關反應。儘管遺傳因素以及應激和/或衰老誘導的轉錄和轉錄後調節因子是改變時鐘輸出的很好的候選者，但這種與年齡相關的晝夜節律重編程是如何調節的仍然是未知的。
最後，從研究發現可看出，晝夜節律性大多是通過單基因報告系統或轉錄水平來衡量的。考慮到生物節律複雜的轉錄後調節，在蛋白質水平和蛋白質修飾水平上評估核心時鐘的狀態，以及代謝組和微生物組的晝夜節律性的測量，這對於進一步加深我們對生物節律在衰老過程中如何影響組織和成體幹細胞功能的理解將是非常重要的。
來源：老頑童說
1980-2020
原標題：《【重磅綜述】成體幹細胞穩態與衰老的晝夜節律調控》
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