染色體重排所導致的基因融合是腫瘤中的常見現象，在腫瘤的發生過程中起著非常重要的作用，約佔人類癌症發病率的20%。目前，國內外已有多種抑制融合基因的腫瘤靶向治療藥物用於臨床，包括伊馬替尼/BCR-ABL1、克唑替尼/EML4-ALK和拉羅替尼/NTRK融合等。
然而，融合基因發生的頻率在不同的癌症中存在很大的差異，許多融合基因只存在於特定的癌症亞型。例如，非小細胞肺癌（NSCLC）中ALK融合基因陽性率為3%~7%；僅2%的ROS1融合基因存在於肺癌患者中；所有實體瘤中NTRK基因融合陽性率平均約為1%，而在某些特定腫瘤中卻高達90%[1,2]。
圖1. 激酶融合基因在原發腫瘤中的分布[3]
機遇與挑戰丨融合基因精準檢測如何實現？
因此，精確檢測融合基因不但可以協助臨床醫生對癌症進行診斷和分型，還能夠為後續的治療提供必要信息。目前，融合基因診斷主要包括螢光原位雜交(FISH)、IHC等。然而，這些檢測方法的解析度和通量通常較低，同時還較為依賴檢驗人員的判斷經驗，而且往往只適用於已知的融合亞型，應用拓展有限，因而常常導致診斷過程漫長、費用昂貴。如圖2所示，由於Deletion區域較小，導致探針仍然可以與目標區域結合，因此，FISH結果並未檢測到GOPC-ROS1融合，出現了假陰性的情況。有報導表明，使用IHC檢測NTRK3融合的靈敏度降低，其中，NTRK1和NTRK2的靈敏度分別為97%和99%，而NTRK3隻有79%；此外，其特異性還與腫瘤類型相關。[5]
圖2. 左：一種FISH檢測GOPC與ROS1融合的假陰性結果的原理示意圖[4]；右：不同腫瘤中的NTRK融合基因IHC染色模式[5]
儘管傳統檢測方法仍將作為腫瘤融合基因診斷的不可或缺的手段，但與此同時，多種新型技術平臺也在逐步走進臨床（表1）。例如，基於雜交/螢光或者質譜技術的融合基因檢測手段在一定程度上避免了技術人員的主觀判斷，更加數位化，在通量提高的同時還具有經濟優勢；但另一方面，現階段臨床研究已發現的腫瘤融合基因超過了10000種，雖然以上技術都具有較高的檢測靈敏度，但它們都不能發現新的融合亞型，仍存在一定局限性。除此之外，基於NGS的錨定擴增子技術雖然方便快捷，也不需要融合的先驗知識，但稍顯不足的是容易產生假陽性，需要利用生物信息管線過濾掉置信度低的融合基因。
表1. 新型基因融合檢測方法[4]
多維對比丨RNA-Cap改善臨床融合基因檢測潛力巨大
值得關注的是，Hybridization-based DNA靶向測序技術（DNA-Cap）近年來憑藉其經濟、不依賴融合先驗知識、新融合亞型的發現能力，以及適用於基因組和游離核酸的廣泛性、高靈敏度等諸多優勢，越來越多地被廣大臨床檢驗實驗室所採用。
當前市面上，多款基於NGS技術的DNA-Cap伴隨診斷產品都具有檢測融合基因的能力，例如MSK-IMPACT等。其整體流程如下：設計覆蓋功能基因內含子區域的探針，將探針與預文庫雜交，捕獲測序，分析統計嵌合型Reads，從而發現融合事件。但單獨使用DNA-Cap檢測融合基因也有一定的局限性：
1.靈敏度
NGS技術的靈敏度與覆蓋度直接相關，有些內含子非常長，如NTRK3中的內含子 (~193kb)。如果覆蓋，將進一步增加成本。此外，有些內含子區域即使在需要的情況下也無法設計探針，因為它們包含了大量重複序列，會降低on-target，同時也較難比對。例如，ROS1的31號內含子，作為主要融合區域（CD74/SLC34A2/SDC），含有90%以上的重複序列。因此，如果融合斷點涉及未覆蓋的內含子區域，而捕獲探針無法覆蓋這些區域，檢測靈敏度將受到影響。例如， 在某些FDA批准的腫瘤大Panel中，對於NTRK融合通常採用熱點內含子部分覆蓋和伴侶覆蓋（NTRK3-ETV6），可能有漏檢的風險（圖3）。
圖3. 不同NTRK融合基因示意圖[6]
2. 特異性
不同的分析軟體導致的假陽性率不同，因此，有研究同時採用多種融合分析軟體以提高特異性[7]；更加值得注意的是，基因組層面的染色體重排或基因融合很難確認融合基因是否表達或功能性。在一項基於NGS的DNA/RNA研究中，使用MSK-IMPACT Panel發現的23例NTRK融合陽性樣本，其中21例確認具有融合轉錄本表達，兩例陰性樣本既沒有融合轉錄本表達（Archer RNA testing）也未檢測到融合蛋白（IHC），該研究顯示了對基因組融合進行驗證的重要性[8]。
儘管有一些研究使用全轉錄組測序來檢測融合基因，但是由於全轉錄組測序在病理檢測後，腫瘤臨床樣本多以FFPE為主的，其RNA一般都有部分降解，質量較低。基於NGS的RNA-seq技術中，mRNA-seq局限性較大，在一項使用mRNA-seq對乳腺癌融合基因的研究中，只有45.7%（32/70）的融合基因可以被RT-PCR和Sanger方法驗證[9]；而使用去核糖體方法時，由於mRNA前體的存在，Intron含量增加、Exon佔比較低，由於RNA降解、去rRNA不充分，表現為有效數據低且不穩定（1%-30% Exon ratio）；除此之外，組織中的非目標基因還將進一步壓縮目標Exon的數據佔比。換言之，全轉錄組測序可以被理解為天然的「WES」，但是由於基因的差異化表達，轉錄本覆蓋會參差不齊，同時又限於實驗技術（去核糖體、逆轉錄等）和生物學（mRNA前體）方面的影響，最終可能需要大量的數據量來提升RNA-seq對融合基因的檢測靈敏度和穩定性（圖4）。
圖4. 左：採用不同RNA-seq方法對低質量RNA樣本（FFPE和新鮮冷凍組織）進行轉錄組檢測的數據佔比分析（RNase-H/橙色、Ribo-Zero/粉色、Total/黑色）[10]；右：Ribo-Zero RNA-seq對腫瘤FFPE和新鮮冷凍組織進行轉錄組測序的數據佔比[12]
相較而言，RNA-Cap技術在融合基因檢測方面則可以克服上述諸多瓶頸。首先，針對轉錄本設計探針避免了內含子區域的幹擾，有效地提高了靈敏度且Panel更小、更加經濟；其次，有效規避rRNA汙染以及內含子和非目標基因幹擾，提高數據有效性和目標區域深度，增加檢測靈敏度（圖5）；更為重要的是，RNA-Cap還能夠在發現融合基因的同時對融合基因的功能（in-frame）和表達量進行評估，對融合基因進行二次驗證。正因如此，現在MSK-IMPACT對入選患者使用DNA-Cap和RNA錨定擴增子技術進行共檢測。
圖5. RNA-Cap（cDNA-Capture）較RNA-seq，Exon佔比(A)、覆蓋深度(B)、覆蓋均一性(C)都有明顯優勢[11]
未來可期丨本土化液相晶片雜交捕獲技術助力融合基因檢測
隨著測序成本的不斷降低、NGS測序儀的本土化，以及腫瘤臨床應用在國內獲批進入臨床，DNA Panel可以進一步提高內含子區域的覆蓋來增加腫瘤融合基因的檢測靈敏度，而內含子區域往往存在大量的重複序列，探針設計困難重重。那麼，如何達到覆蓋率與On-target的平衡呢？
國內自主智慧財產權的液相晶片雜交捕獲技術供應商伯科生物近年來通過「實驗-學習-驗證」的系統摸索，建立了探針特異性（長度、GC、錯配和Gap等參數）與捕獲效率的數學模型，形成了其獨有的Panel On-target預測系統（圖6A）。在一個項目中，該公司用戶直接提供探針區域用於合成，其產品研發團隊在預測On-target並與用戶溝通後，刪除了不涉及臨床熱點突變的~0.5%的「Bad」探針，驗證實驗表明，在刪除「Bad」探針後，Panel A（170Kb）和Panel B（230Kb）的On-target從18.4%和13.9%，提升至69.5%與79.5%，滿足產品預期（圖6B）。在另一款定製產品中，針對用戶提供的~700Kb的內含子區域，該公司探針設計覆蓋率達到89%，遠高於友商I的64%，同時，On-target達到85%以上，表現優異（圖6C）。
圖6. 伯科探針設計平臺對探針特異性進行有效預測
對於RNA-Cap Panel，伯科生物針對全長轉錄本設計探針，並對多轉錄本和可變剪接特殊設計，同時提供DNA汙染監控模塊、ERCC外參探針模塊以及常見融合型探針供用戶選擇。據悉，目前伯科生物已完成多款RNA-Cap的設計與合成，並助力臨床需求對DNA/RNA共捕獲技術的開發。在將DNA-Cap和RNA-Cap整合為共捕獲流程後，操作簡便，可以對SNV、Indel、Fusion等多種突變類型進行檢測，同時基因組與轉錄組相互驗證，結果更加準確；此外，還可以進行組織溯源和分子分型。如圖7所示，DNA&RNA共捕獲流程較單獨使用DNA-Cap時，融合基因檢測靈敏度更高，此外，在基因表達量分析方面，該流程與RNA-seq也具有極高的相關性。
圖7. DNA&RNA共捕獲技術流程示意圖與融合基因檢測性能
結 語
同時評估基因組變異與變異基因表達，通過DNA&RNA共捕獲對融合基因的二維檢測方式，可以說是精準醫療發展的一個縮影，從一藥一檢到腫瘤小Panel/大Panel，再到WES，腫瘤伴隨診斷技術正以前所未有的速度不斷完善，相信隨著技術的成熟和測序成本的降低，高通量測序必將更好的服務於患者。
伯科生物擁有國內獨家的高通量核酸合成與修飾技術，致力於建立從寡核苷酸、DNA/RNA序列片段到染色體基因組成和構建的全流程合成生物學平臺，目前該公司已經完成多組學基因晶片的設計軟體、合成平臺以及高性能雜交緩衝液和Blocker產品的開發，形成了針對不同應用場景的多種整體解決方案，並為大量用戶提供了包括甲基化、Nanopore納米孔靶向測序在內的基因晶片產品。
基因Panel的設計與合成等上遊技術此前一直被國外公司壟斷，如今，隨著以伯科生物技術為代表的具有我國自主智慧財產權的技術平臺與產品問世，相信它們在未來將創造更大價值，為中國精準醫療事業的發展積極助力。