公元1616年，努爾哈赤建立後金，不斷南下侵擾明朝東北邊境。1620年夏，後金兵再侵遼東，岌岌可危，朝廷詔令各地派兵北上援遼，秦良玉派遣其兄秦邦屏和弟弟秦民屏率五千白杆兵先行，隨後自統三千白杆兵與兒子馬祥麟跟進。此時秦良玉46歲，馬祥麟20歲。史載馬祥麟船銀鎧，騎白馬，高大威猛，彪悍英武。他們晝夜兼程趕到遼陽。公元1621年3月，金兵圍困瀋陽，秦氏兄弟疾馳往援。兵至渾河，獲悉瀋陽已失守。眾軍並未退卻，稍作準備，便渡過渾河，尚未結營，就遇上了後金的先頭部隊。秦氏兄弟帶領白杆兵與金兵展開激烈的戰鬥，不久後金主力趕到，將明軍團團圍住。在激戰中，秦邦屏和一千多白杆兵捐軀沙場。秦民屏重傷，拼死突圍。危急時刻，秦良玉帶兵趕到搶出秦邦屏的屍體，就出秦民屏。激戰中，馬祥麟一馬當先，衝入敵陣，斬敵無數，卻被流矢射中一目，他忍痛拔出箭鏃，彎弓搭箭射向遠處的敵人，連發三箭箭無虛發，後金兵大驚，紛紛後退。
此戰史稱「渾河血戰」，是後金遼左用兵以來的第一血戰。雖因兵力懸殊，最終敗退，卻震懾了後金兵，努爾哈赤深感「川兵之勁厲」。渾河一站，秦良玉和白杆兵名震朝野，明熹宗御賜馬祥麟「忠義可嘉」匾額，授指揮使。賜秦良玉為誥命夫人，進二品服。命回川後再徵兵二千赴援遼東。
1621年秋，秦良玉率軍回到石柱，恰逢四川永寧土司發動叛亂，經過兩年，秦良玉擊敗了叛軍，明朝廷授秦良玉為都督僉事，拜石柱總兵官。她由原來的土司上升為朝廷石柱地區的軍政最高首腦。一代女傑，從此成為獨當一面、鎮守一方的朝廷軍政長官。
1629年，後金可汗皇太極攻榆關（山海關）不久，利用漢奸高洪中的建議，率軍繞過袁崇煥駐防的遼東，到長城喜峰口入侵，攻陷遵化後，進抵北京城外，連克永平四城。北京城危急，明朝廷急急下詔各地火速進京勤王。各地駐軍急速奔馳北京。秦良玉拿出自己的全部家產作為軍餉，率軍星夜兼程直抵宣武門，並配合各路兵馬，英勇殺敵，逼退了皇太極的軍隊。解了北京之圍後，崇禎帝召見了秦良玉，並御筆賦詩四首贈送給秦良玉：
其一：學就西川八陣圖，鴛鴦袖裡握兵符。由來巾幗甘心受，何必將軍是丈夫。
其二：蜀錦徵袍自裁成，桃花馬上請長纓。世間多少奇男子，誰肯沙場萬裡行。
其三：露宿風餐誓不辭，飲將鮮血代胭脂。凱歌馬上清平曲，不是昭君出塞圖。
其四：憑將箕帚掃胡虜，一片歡聲動地呼。試看他年麟閣上，丹青先畫美人圖。
能得到皇帝面見賜詩，秦良玉當屬古往今來第一人。
後金兵推出北京後，秦良玉率兵返回家鄉，留下兒子馬祥麟，兒媳張鳳儀，侄子秦義明留守京師，後兒子奉命駐守襄陽。當時農民軍張獻忠、羅汝才等九路人馬進攻四川，朝廷命秦良玉負責守御川地，此後十年，秦良玉帶兵與張獻忠反覆搏戰，互有勝負。1644年，李自成農民軍攻破北京，崇禎帝自縊煤山，明朝滅亡。隨後，清軍入關，進軍中原。秦良玉獲悉後，率部眾披麻戴孝，痛哭不止。此後，秦良玉以明朝遺老自居，發誓不予清朝合作。
1646年，清軍大舉南下。南明隆武政權賜封秦良玉「太子太保忠貞侯」封號和「太子太保總鎮關防」官印，令她在四川繼續抗擊清兵，保境安民。72歲高齡的秦良玉毅然接受風雨飄搖的南明政權的上述封號。不久，傳來兒子城破殉國的消息，這更加激勵了秦良玉抵禦清軍的決心。他在石柱招兵買馬，舉起抗清大旗，並以萬壽寨為據點，率軍抵抗清軍，威武不屈，絕不向清軍投降。
公元1648年，南明永曆帝加封75歲的秦良玉為太子少傅，授四川招討使，令據守四川。久臥病床的秦良玉聞之瞿然而起，拜伏受詔，感泣道：「老婦人朽骨餘生，實先皇帝（崇禎）恩賜，定當負弩前驅，以報皇恩！」幾日後，秦良玉抱病檢閱白杆兵，準備出徵。當她手握跟隨她徵戰幾十年的白杆銀槍，踏上馬背後，便身子一歪，倒在馬背上。副將上前探她鼻息，發現秦良玉已經逝去。眾將士失聲痛哭。
一代女傑，就此結束了她傳奇的一生。她是中國歷史上唯一一位被《二十四史》加載「將相列傳」的女性。