作者：山東大學齊魯醫院 趙達旺
椎間盤退變引起的腰背痛嚴重影響患者生活質量。椎間盤退變的治療包括保守治療和手術治療，但兩者均不能逆轉椎間盤退變的病理狀態。近年，幹細胞再生療法為治療椎間盤退變提供了新選擇，其具有以下特點：通過產生細胞外基質重新填充椎間盤，恢復受損組織；不引起額外的椎間盤損傷；可分泌生長因子調節炎症反應，加強組織再生。隨著幹細胞研究不斷深入，幹細胞治療椎間盤退變的體內外實驗獲得持續進展，生物支架得到廣泛運用，同時也開展了一些臨床試驗，評估治療的有效性和安全性。椎間盤退變的幹細胞治療中，種子細胞選擇是首要考慮的問題，常用的外源性幹細胞包括骨髓間充質幹細胞、脂肪幹細胞和臍帶間充質幹細胞。本文對應用幹細胞治療椎間盤退變的研究進展作一綜述。
骨髓間充質幹細胞
體外實驗 骨髓間充質幹細胞相對容易獲取且具有免疫調節功能，近年來很多學者將其作為種子細胞用於椎間盤退變治療的研究中。Gan等的研究探索了相對寬幅度動態壓縮對3D骨髓間充質幹細胞培養系統的影響，發現該培養系統在無壓縮組和低幅度壓縮組均表現出良好的細胞相容性和細胞活力，而在中等幅度和高幅度壓縮組則出現細胞活力下降，這表明低壓機械環境有利於骨髓間充質幹細胞的成骨分化；與無壓縮組相比，低幅度壓縮組的糖胺聚糖和羥脯氨酸的mRNA和蛋白表達均增加，這將更有利於細胞外基質沉積。他們推測，低幅度壓縮促進3D培養系統的合成代謝可能是通過瞬時感受器電位香草素4通道依賴途徑完成的。Gao等探究了機械應力促進髓核細胞外基質合成的作用機制，採用0～0．2MPa和0．1Hz的周期性機械應力作用於髓核細胞，發現周期性機械應力能夠有效促進Ⅱ型膠原α1鏈、聚集蛋白聚糖和整合素α1的mRNA表達，並促進磷脂酶Cγ1的磷酸化。
外泌體是細胞分泌的特異性膜泡，在細胞通訊中發揮重要作用。Lu等研究發現，髓核細胞和骨髓間充質幹細胞均可分泌外泌體，髓核細胞來源外泌體可促進骨髓間充質幹細胞遷移並誘導其分化為髓核樣表型的細胞；骨髓間充質幹細胞來源外泌體可促進髓核細胞增殖並產生新的細胞外基質。深入研究退變髓核細胞與外源性幹細胞之間的外泌體通訊機制具有重要意義。
體內實驗 骨形態生成蛋白（BMP）－7是轉化生長因子（TGF）－β超家族的一員，其可增加髓核細胞活力，促進細胞外基質產生，增高椎間盤高度，上調髓核蛋白聚糖的表達。Xu等的研究發現，慢病毒介導的過表達BMP－7可誘導骨髓間充質幹細胞向髓核表型分化，Smad1沉默可抑制以上作用，表明BMP－7在細胞外基質重構方面的作用由Smad信號轉導通路介導。
張子琦等將微囊化軟骨細胞與骨髓間充質幹細胞共培養，結果顯示共培養後骨髓間充質幹細胞的增殖能力未受明顯影響，但增加了軟骨細胞的部分表面特徵，並且能夠合成蛋白多糖及Ⅱ型膠原蛋白；將共培養後的骨髓間充質幹細胞植入椎間盤退變的動物模型，與對照組相比，植入幹細胞後椎間盤顯示更好的形態、結構及力學特徵。
在組織工程中，生物支架能夠維持細胞功能並為細胞提供機械保護。Gan等成功建立葡萄聚糖－明膠水凝膠裝載TGF－β的生物支架，並使用該支架有效誘導小鼠骨髓間充質幹細胞向髓核樣細胞分化，促進相關細胞外基質基因的表達。Wu等製作功能性自組裝肽納米纖維支架，並驗證該支架具有促進骨髓間充質幹細胞髓核樣分化、增殖以及趨化性遷移的能力。生物材料負載幹細胞的策略是再生醫學的研究重點，材料植入後的體內免疫排斥反應需得到更多關注。
臨床試驗 目前，已有學者將骨髓間充質幹細胞用於臨床試驗。Elabd等研究低氧條件下培養自體骨髓間充質幹細胞治療慢性腰背痛的可行性和長期安全性，發現5例患者中4例突出物體積減小，在長期隨訪中5例患者均達到可保持椎間盤高度或僅輕度降低，生活質量問卷調查顯示大多數患者達到病情總體改善，力量和活動能力均有提高。儘管該研究為小樣本（5例患者）臨床試驗，但也證實了骨髓間充質幹細胞治療人椎間盤退變的有效性和生物安全性。
脂肪幹細胞
脂肪幹細胞也是一類具備再生椎間盤潛力的幹細胞，其在標準培養條件下即可擴增，並展現出多能分化潛力。
體外實驗 Sun等的研究是首個在非生理機械刺激環境下評估脂肪幹細胞對髓核細胞作用的體外實驗。研究表明，脂肪幹細胞通過抑制caspase－9和caspase－3阻止髓核凋亡；通過增加細胞外基質的產生促進金屬蛋白酶組織抑制因子的表達，抑制基質金屬蛋白酶、聚蛋白多糖酶和促炎因子的表達，顯示出對髓核細胞的有益作用。儘管研究中未發現脂肪幹細胞對髓核標記物表達的影響，但其可抑制細胞角蛋白8的減少。
組織工程學實驗 在幹細胞治療椎間盤退變的研究中選擇合適的幹細胞支架仍是重要問題之一，可注射性黏彈性支架是較好的選擇。水凝膠樣支架在遞送細胞過程中呈低黏度，注射後可原位凝膠化，起到填充微觀、宏觀裂縫以及恢復椎間盤高度的作用，因此水凝膠樣支架是理想的支架系統。交聯是穩定生物材料最常用的方法，許多水凝膠樣支架的凝膠速度由交聯調節。交聯方式主要有物理交聯和化學交聯，物理交聯（如光交聯）可能對遞送細胞產生毒性，化學交聯（如戊二醛等）能有效提高生物支架穩定性，但交聯劑的毒性和誘導鈣化性限制了其長期植入的可能。京尼平因具有天然低毒性而被廣泛應用於研究中。Zhou等使用不同濃度京尼平交聯Ⅱ型膠原生成支架，通過檢測支架的微觀結構、表面形貌、機械強度、孔隙率、溶脹性質和生物學穩定性評估支架性質，通過測定細胞增殖、基因和蛋白質表達量評估支架對脂肪幹細胞的生物學效應。他們的研究證實：①京尼平可增加Ⅱ型膠原支架穩定性，但也改變了支架構型和Ⅱ型膠原的內在特性；②含0．1％京尼平的交聯支架在保持支架構型基礎上可提升生物穩定性；③含0．1％京尼平的交聯支架可促進脂肪幹細胞增殖和髓核樣分化，並促進音蝟因子基因和蛋白的表達。
Zhou等製作的京尼平交聯Ⅱ型膠原－硫酸軟骨素複合支架具備原位凝膠化能力，並在體內外實驗中驗證該支架具有誘導脂肪幹細胞髓核樣分化及再生椎間盤的能力。他們首先在研究中確定含0．02％京尼平的交聯支架能提供最好的細胞相容性。體外實驗發現，與對照組（僅含脂肪幹細胞）和交聯支架負載脂肪幹細胞組相比，含0．02％京尼平的交聯支架負載脂肪幹細胞組的聚集蛋白聚糖基因、Sox9基因及其蛋白表達均更高，Krt19表達量在第14天分別為對照組的4．87倍和交聯支架負載脂肪幹細胞組的3．29倍，Pax1表達量在第7天和第14天分別是對照組的4．99倍和11．62倍（聚集蛋白聚糖、Sox 9基因和蛋白的表達水平代表脂肪幹細胞基質的合成能力，Krt19和Pax1則是髓核細胞的特異性基因標誌物）。在動物實驗中，他們對大鼠尾退變椎骨注射載有脂肪幹細胞的支架系統，通過X線和MRI檢查測定椎間盤高度指數，進行組織學分析、免疫組化分析，以及硫酸鹽黏多糖及羥脯胺酸含量測定，發現該支架系統有利於髓核組織再生。
在該類支架的相關研究中，交聯劑的種類和濃度、水凝膠樣支架的成分、緩釋生物粒子以及材料的表面改性等均是需進一步研究的方向，這些研究可為治療椎間盤退變提供更佳的生物材料。除水凝膠樣支架外，生物支架也有應用。Zhou等通過模擬天然髓核成分製作脫細胞髓核支架，並將其加載脂肪幹細胞後注射於兔椎間盤退變模型，結果證實脫細胞髓核遞送系統具有與新鮮髓核組織相似的機械性能和生物相容性，並能夠誘導脂肪幹細胞的髓核樣分化，增加細胞外基質合成。生物支架因具有低免疫原性和良好的生物相容性，是治療人椎間盤退變的理想支架系統。
臨床試驗 Kumar等開展了脂肪幹細胞治療椎間盤退變的Ⅰ期臨床試驗。他們將TissuefilloR（韓國食品藥品安全部批准其用作細胞遞送和缺損組織填充的材料）聯合自體脂肪幹細胞注射入10例椎間盤退變患者的退變部位，在治療及12個月的隨訪中未發現細胞移植引起的不良事件和其他嚴重不良事件，未觀察到骨贅形成和椎間盤縮小；治療前患者的疼痛視覺模擬評分（VAS）為（6．50±1．27）分，治療後1個月和12個月VAS降低至（4．60±1．07）分和（2．90±1．66）分；治療前患者的腰椎功能障礙指數（ODI）為42．80％±15．03％，治療後1個月和12個月ODI下降至31．20％±13．86％和16．80％±9．77％；表觀彌散係數圖顯示，3例患者的椎間盤含水量增加。該臨床試驗的成功表明了脂肪幹細胞治療椎間盤退變的有效性和安全性將對幹細胞治療人椎間盤退變的研究產生重要影響。
臍帶間充質幹細胞
與其他種類幹細胞相比，臍帶間充質幹細胞治療椎間盤退變的研究報導較少。Qi等的研究發現，臍帶間充質幹細胞能夠通過增加Bcl－2表達，降低Bax表達，調節細胞凋亡和有絲分裂，以保護髓核間充質幹細胞免受高糖損傷。臍帶間充質幹細胞能夠顯著上調髓核中Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的表達，從而促進細胞外基質的生成。此外，臍帶間充質幹細胞可通過p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號轉導通路減輕高糖環境下細胞外基質的降解。這些均有利於椎間盤退變的修復。Pang等數年前進行了臍帶間充質幹細胞治療慢性椎間盤源性腰痛的臨床試驗，在治療後的2年隨訪中，2例患者的VAS、ODI評分均明顯下降。
結語
近年來，椎間盤退變的幹細胞治療出現許多新穎研究。在動物模型上進行幹細胞治療椎間盤退變的有效性已得到廣泛證實，但還需要開展更多的體內外實驗，進一步了解幹細胞的分化機制，確定高效安全的幹細胞種類和數量，尋找最佳載體和遞送方法。進行臨床轉化前，必須在動物模型上驗證其療效和安全性。
來源：國際骨科學雜誌2019年7月第40卷第4期
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