喀斯特由石灰巖等高度可溶和多孔的基巖溶解而形成，通常是陡峭而高的懸崖，除了金屬離子之外其他養分都很貧乏。
烏葉猴屬可分為戴帽葉猴組、鬱烏葉猴組（T. obscurus group）、銀葉猴組（T. cristatus group）和黑葉猴組4個組。其中，黑葉猴組全部分布於喀斯特石山區域，因此通稱為「石山葉猴」。根據分布緯度從高到低，黑葉猴組又可分為：黑葉猴（T. francoisi）、金頭葉猴（T. poliocephalus）、白頭葉猴（T. leucocephalus）、德氏烏葉猴（T. delacouri）、越南烏葉猴（T. hatinhensis）、寮國烏葉猴（T. laotum）和印支烏葉猴（T. ebenus）。所有7種石山葉猴都呈現出黑色的皮毛，但不同種類的葉猴頭部、臀部或尾部的白色或金色部分的程度不同；這在白色、黃色和黑色巖層中可能是一種偽裝。
石山葉猴通常睡在洞穴或巖石庇護所下，可以很容易地在陡峭的巖石上行走、攀爬和跳躍。而他們飲用喀斯特洞穴的水，舔食石灰巖，並食用忍冬等含有更高鈣含量的植物葉片，這些使得它們通常會攝入較高的鈣含量。
雖然各種靈長類動物的基因組已經被測序，但烏葉猴屬的基因組信息卻是缺乏的，因此相關機理一直未被完全破譯。
基因組denovo：
雄性黑葉猴（T. francoisi）全血
重測序：
5個石山葉猴： 黑葉猴 、白頭葉猴、寮國烏葉猴、印支烏葉猴、越南烏葉猴；
4個雨林葉猴：印尼烏葉猴(T. germaini)、烏葉猴 (T. auratus) 、菲氏葉猴(T. phayrei) 及鬱烏葉猴 (T. obscurus) ；
共23個樣高深度的重測序分析（～30.79±4.73X）
轉錄組：
黑葉猴和白頭葉猴尾部毛囊（各3重複）
1. 黑葉猴基因組組裝及陽性選擇基因（PSGs）的鑑定及富集
2. Ca2+信號通路相關基因的篩選及同源基因家族進化
3. 石山葉猴和雨林葉猴的系統發育關係及種群歷史分析
4. 黑葉猴和白頭葉猴的分化和毛皮顏色變異的基因組機制
1. 黑葉猴基因組組裝及陽性選擇基因（PSGs）的鑑定及富集
研究者對雄性T. francoisi進行基因組組裝，使用 Illumina(598.37 Gb)＋ PacBio(272.97 Gb)＋Hi-C(151.6Gb )共組裝2.87Gb基因組，contig N50為16.3 Mb ，並將基因組定位到22條染色體上，共25,421個蛋白編碼基因被注釋。
黑葉猴與其他11個靈長類物種進行基因組比較，發現金絲猴與石山葉猴的分化時間為（9.30±3.30 MYA)，鑑定到一些同源基因家族的擴張與收縮（圖1）。並且在黑葉猴中鑑定出了130個陽性選擇基因（PSGs）。
結合23個葉猴樣高深度的重測序分析結果顯示在這130個陽性選擇基因中：
1）56個PSGs是在石山與雨林葉猴中共有；
2）56個在調查的五種石山葉猴中共有；
3）5個在黑葉猴和白頭葉猴中共有；
4）13個僅在黑葉猴中存在；
因此，僅在五種石山葉猴中共有的56個PSGs是與所有石山葉猴相關的陽性選擇潛在基因。這56個PSGs在KEGG途徑中顯示出「鈣信號」和「催產素信號」，以及「血管收縮」、「血液循環」和「肢體形態發生」的富集，暗示了石山葉猴對喀斯特生境潛在的生理和形態適應。
圖1 黑葉猴比較基因組分析
2. Ca2+信號通路相關基因的篩選
在「鈣信號通路」裡與鈣離子信號傳導、鈣離子跨膜轉運以及細胞內鈣離子調控相關的七個基因中，都觀察到黑葉猴中有一個正選擇的胺基酸替換，ExAC資料庫顯示這些替換的等位基因頻率在人類群體中極低（0-0.000025），表明這七個胺基酸位置在人類中高度保守（表1）。
表1 石山葉猴鈣信號和催產素信號通路中PSGs的胺基酸替換及人類ExAC資料庫中的等位基因頻率
在大多數靈長類動物中，血鈣濃度範圍為2.15 mmol/L-2.83 mmol/L，而黑葉猴的血鈣濃度（3.31±0.27mmol/L）明顯更高（圖2B）。通過檢查其他石山葉猴、四隻雨林葉猴、兩隻金絲猴（R.bieti和R.roxellana）、兩隻獼猴（M.mulatta和M.fascularis）、人類和11隻其他靈長類動物，發現這七種胺基酸的替代僅存在於所有石山葉猴（圖2D），這意味著石山葉猴可能適應高鈣離子的細胞外環境。
在石山葉猴和雨林葉猴基因組中發現了大量的直系基因家族擴張，它們參與了「肌肉適應調節」和「肌肉收縮調節」過程。並發現了與「鐵離子結合」和「陽離子轉運」相關的基因組家族僅在五種石山葉猴中發生擴張，意味著這些基因家族的擴張發生在石山葉猴與雨林葉猴分化後，是在石山葉猴的共同祖先中發生（圖2）
圖2 石山葉猴對高血鈣離子濃度的基因組適應
通過對位於細胞膜上的電壓門控鈣離子通道蛋白（CAV1.2）的點突變細胞鈣離子成像實驗和全細胞膜片鉗實驗，結果顯示相比於祖先基因型，黑葉猴基因型的CAV1.2通道具有有效減少鈣離子內流的作用。研究提示該基因的點突變可能是石山葉猴適應喀斯特環境的機制之一（圖3）
圖3 電壓門控鈣離子通道蛋白（CAV1.2）點突變細胞鈣離子成像實驗和全細胞膜片鉗實驗.
3. 石山葉猴和雨林葉猴的系統發育關係及種群歷史分析
烏葉猴屬祖先在歷史上約2.9個百萬年前分化形成石山葉猴和雨林葉猴兩大類群，而黑葉猴種組黑葉猴、白頭葉猴、寮國烏葉猴、印支烏葉猴和越南烏葉猴的祖先約在1.1個百萬年前開始分化（圖4）。希夏邦馬冰期 （XG，1170—800千年前，KYA）期間，大部分雨林葉猴和石山葉猴經歷了一次種群數減少，隨後在中更新世時期（800—200 KYA）中有一次擴張。第二次下降發生在200 KYA，與倒數第二次冰期（PG，200–130 KYA）和最後一次冰期重合 (LG, 70–10 KYA)（圖4）。
4. 黑葉猴和白頭葉猴的分化和毛皮顏色變異的基因組機制
黑葉猴與白頭葉猴除毛色差異外，生存環境和習性極其相似，基於種群基因組學的選擇消除分析（FST、θπ比值和XP-EHH分析）提示在白頭葉猴中，黑色素合成信號通路相關基因受到顯著的正選擇，且轉錄組分析揭示黑色素合成信號通路中的關鍵基因EDNRB在白頭葉猴中的表達量遠低於黑葉猴。因此研究推斷EDNRB基因是在自然選擇過程中，在白頭葉猴遺留下來的環境適應性毛色表型的關鍵機制。
圖5 黑葉猴和白頭葉猴毛色變異的基因組機制
了解非人靈長類動物的生理形態進化和適應，對於了解人類起源、生理生態學、形態進化及其在生物醫學中的應用具有重要意義。特別是石山葉猴是適應高鈣和惡劣環境挑戰的直接例子。研究者組裝了一種雄性黑葉猴的新基因組，並通過系列研究使對靈長類生態分類群中的基因-環境相互作用和生理-形態適應機制有了一個新的認識。
靈長類動物種群數量的減少和滅絕風險的增加，是遺傳多樣性中不可替代的損失。這些靈長類動物對科學研究、生態系統健康和人類都具有不可估量的價值，隨著越來越多的基因組的出現，多種研究手段將增強我們對世界範圍內非人類靈長類動物的認識，並將有助於地球上稀有物種的保護工作。
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排版：市場部