雙螢光素酶報告基因檢測，快來學習

螢光素酶（英文名稱：Luciferase）是自然界中能夠產生生物螢光的酶的統稱，其中最有代表性的是一種學名為Photinus pyralis的螢火蟲體內的螢光素酶。在相應化學反應中，螢光的產生是來自於螢光素的氧化，有些情況下反應體系中也包括三磷酸腺苷（ATP）。沒有螢光素酶的情況下，螢光素與氧氣反應的速率非常慢，而鈣離子的存在常常可以進一步加速反應（與肌肉收縮的情況相似）。

雙報告基因用於實驗系統中作相關的或成比例的檢測, 通常一個報告基因作為內對照, 使另一個報告基因的檢測均一化。檢測基因表達時雙報告基因通常用來瞬時轉染培養細胞，帶有實驗報告基因的載體共轉染帶有不同的報告基因作為對照的第二個載體。通常實驗報告基因偶聯到調控的啟動子, 研究調控基因的結構和生理基礎。報告基因表達活力的相對改變與偶聯調控啟動子轉錄活力的改變相關，偶聯到組成型啟動子的第二個報告基因，提供轉錄活力的內對照, 使測試不被實驗條件變化所幹擾。

通過這種方法, 可減少內在的變化因素所削弱的實驗準確性, 比如, 培養細胞的數目和活力的差別,細胞轉染和裂解的效率。

理想的雙報告基因方法應該使用戶能夠以螢火蟲螢光素酶所具有的速度,靈敏和線性範圍對同一樣品中的兩個報告基因同時測定。這在傳統的報告基因, 如CAT, β-Gal和GUS是不可能的, 由於它們測試化學,處理要求所固 有的局限。相反 , 結合螢火蟲 ( Photinus pyralis ) 和海洋腔腸 ( Renilla reniformis ) 雙螢光素酶的系統可滿足這些要求，在單管中完成這些測試。

雙螢光素酶檢測課程：http://weike.fm/Zeakx2a7aa

雙螢光素酶報告基因檢測原理：

將目的基因3』UTR區域或者lncRNA序列構建至載體中報告基因Luciferase的後面，構建螢光素酶質粒。然後轉染至細胞中，通過比較過表達或者幹擾miRNA後，檢測報告基因表達的改變（以螢火蟲螢光素酶為報告基因，以海腎螢光素酶為內參基因）可以定量反映miRNA對目的基因的抑制作用。結合定點突變等方法進一步確定miRNA與靶基因3』UTR的作用位點。

怎麼找雙螢光素酶檢測靶點？可以查看我們之前的文章： https://www.toutiao.com/i6795463900700606987/

常用螢光素酶報告基因載體：

1、pRL-TK這個載體是由Promega開發的，pRL-TK是海腎螢光素酶報告載體，含有SV40增強子，質粒圖譜如下所示：

2、pGL3-Basic是螢火蟲螢光報告載體，圖譜如下圖所示：

從這兩個圖譜中可以發現，ppGL3-Basic這個載體主要是用於評估miRNA與靶基因3』UTR的結合，靶基因的3』UTR放在螢光素酶的後面，這個螢光素酶是熒火蟲螢光素酶，而pRL-TK這個載體則表達海腎螢光素酶，將這兩個質粒共同轉染進入293細胞中來檢測螢光時，pRL-TK這個質粒起到一個內參的作用。

3、pmir-GLO將熒火蟲螢光素酶與海腎螢光素酶構建到一個載體上，偏差更小且單質粒轉染比雙質粒共轉染更簡單。該質粒也是由promega公司開發的，圖譜如下所示：

實驗基本流程：

1、重組質粒製備: 製備含有待檢測基因Luc/Rluc的重組質粒；

2、共轉染: 將帶有Luc/Rluc標記的報告基因和目的基因進行共轉染，通常24-48h；（選擇轉染效率較高的HEK-293T細胞或原代細胞等）

3、細胞處理: 雙螢光素酶檢測試劑盒依照protocol操作；

4、螢光檢測: 使用酶標儀或具有類似檢測功能的設備進行螢光強度檢測

5、數據分析

實驗案例：

CDK9是miR-206的靶標(a)，但是CDK9突變型不是miR-206的靶標(b)。通過構建出螢光素酶報告載體，將螢光素酶與CDK9基因連接(b)，然後轉染到細胞內進行檢測。結果表明，miR-206 inhibitor顯著的提高了WT-CDK9的相對螢光素酶活性，但是對MUT-CDK9沒有明顯的影響(c)。qPCR測量了CDK9在不同細胞內的表達水平，經過miR-206 inhibitor處理後，CDK9的mRNA表達水平均有明顯上升(d)。以上結果說明，miR-206可以結合CDK9，對CDK9的表達水平進行調控，進而影響細胞周期。