最近小編收到很多老師諮詢雙螢光素酶報告基因服務的留言，現選取了幾個共性問題給大家回復一下～
Q : 您好，我們實驗室的學生做雙螢光素酶報告基因實驗轉染效率很低而且復孔重複不出來，想諮詢一下原因
A : 轉染效率低的話可以從三個方面改善，首先要確保細胞狀態是好的，通常我們選出處於分裂期的細胞，另外陽性對照您可以選擇過表達的螢光蛋白質粒，還有就是DNA的質量尤為重要，最好是先酶切驗證。
這個實驗檢測結果很靈敏，有一定差異是正常的，通常只要確保它在一個數量級之內即可。如果差異超出這個範圍可以從兩方面改善，一是記住保持樣本的均一性，二是加樣要準確。
Q : 樣品裂解效率低怎麼解決呢？
A : 首先要確保實驗者加入了足夠的裂解液，其次就是細胞培養時間最好不要超過36小時，因為培養時間過長會加大裂解難度
Q : 海腎螢光素酶和螢火蟲螢光素酶相比，相對活性如何？
A : 在氧、鎂和ATP的存在下，螢火蟲螢光素酶作用於甲蟲螢光素，而來源於海洋腔腸（Renilla reniformis)的螢光素酶在氧的存在下作用於海腎螢光素。雙報告基因技術（Dual-reporter assays）,結合了螢火蟲螢光素酶測試和海腎螢光素酶測試。
Q : 海腎螢光素酶載體有哪些？
A : 有4個不同的載體，pRL-SV40 載體、pRL-CMV 載體、pRL-TK 載體、pRL-null 載體。
Q : 雙螢光素酶報告基因服務應用方向？
A :1. 驗證microRNA同mRNA靶向互作。將待測mRNA的3』UTR序列插入報告基因載體，再共轉入該microRNA，如果螢光素酶活性下降，則提示為其靶序列。
2. 驗證microRNA同lncRNA靶向互作。將候選的lncRNA序列插入報告基因載體中F-Luc的3』UTR區域，檢測螢光素活性。
3.啟動子結構分析。將啟動子區域序列（通常2k左右）進行分段截短，或對特定位點進行突變，再分別構建入luciferase報告載體，檢測其啟動子活性。
4. 啟動子SNP分析。一些基因的啟動子區域存在單核苷酸多態性，可運用螢光素酶報告系統分析其相對活性。
5. 驗證特定轉錄因子同其調控序列的作用。將該序列（通常為啟動子區域）插入報告基因載體，同時在實驗細胞中共轉過表達該轉錄因子，可分析轉錄因子過表達是否提高螢光素酶活性。
6. 可以分析信號通路是否激活。將該信號通路的下遊響應原件序列構建入報告基因載體，在不同上遊信號條件下，螢光素酶活性代表了通路的下遊響應。例如，在GPCR研究中，將cAMP response element（CRE）載入報告基因載體，構建穩定表達細胞株後，可以用於分析GPCR的激活與抑制劑篩選。又如，將HIF1α的響應原件hypoxia-responsive element (HRE)插入luciferase報告載體構建穩轉細胞株，可以用於低氧相關通路的研究。
Q : 可以介紹一下貴公司的雙螢光素酶報告基因服務嗎?
A : 雙螢光素酶報告基因用於實驗系統中作相關的或成比例的檢測，通常一個報告基因作為內對照，使另一個報告基因的檢測均一化。檢測基因表達時雙報告基因通常用來瞬時轉染培養細胞，帶有實驗報告基因的載體共轉染帶有不同的報告基因作為對照的第二個載體。通常實驗報告基因偶聯到調控的啟動子，研究調控基因的結構和生理基礎。報告基因表達活力的相對改變與偶聯調控啟動子轉錄活力的改變相關，偶聯到組成型啟動子的第二個報告基因，提供轉錄活力的內對照， 使測試不被實驗條件變化所幹擾。通過這種方法，可減少內在的變化因素所削弱的實驗準確性，如培養細胞的數目和活力的差別，細胞轉染和裂解的效率。
Q : 請問貴公司的服務流程是怎樣的？
A : 我們的公司的服務流程依次是接受訂單及樣品、序列分析、合成或擴增目的片段亞克隆至目標載體 、293T細胞共轉染pGL3-basic、pRL-TK質粒、螢光素酶反應發光檢測 、結果分析。
Q : 如果讓你們做，我需要提供什麼呢？
A : 您需要提供：1.基因模板，需提供詳細的轉錄因子、目的基因或microRNA信息；2.實驗細胞，如無特殊要求，金開瑞默認為使用293T細胞，則無需提供。
Q : 最終實驗做完了，你們給我的實現結果包括哪些？
A : 實驗流程及完整報告一份，包括實驗原始數據、圖片、分析結果等。