研究構建雙同源重組報告系統

2020-11-30 生物谷




近期，國際學術期刊Journal of Biological Chemistry 在線發表了中國科學院分子細胞科學卓越創新中心/生物化學與

細胞生物學

研究所周斌研究組的科研成果「Triple-cell lineage tracing by a dual reporter on a single allele」。該研究基於Dre-rox和Cre-loxP雙同源重組系統，構建了一種新的雙同源重組報告系統，可以達到在體內同時標記示蹤三種細胞群。這一研究為新型雙同源重組報告系統的構建提供了新的思路，進一步擴充了雙同源重組報告系統庫，並為發育、疾病和再生研究提供了新的技術選擇。

基於基因位點特異性重組酶系統的

遺傳

譜系示蹤技術被廣泛應用於器官發育、組織再生和疾病研究。目前，多種重組酶系統被普遍使用，例如Cre-loxP、Flpe-frt和Dre-rox系統。其中使用最普遍的為Cre-loxP系統。Cre重組酶受組織或細胞特異性啟動子驅動，當Cre識別兩個同向loxP位點之後，會誘導Cre-loxP重組，並將兩個loxP位點之間的轉錄終止序列切除，從而使轉錄終止序列之後的報告基因表達。由於這種切除事件發生在基因水平上，具有永久性和不可逆性，因此表達Cre的細胞群及其子代細胞（無論是否還在表達Cre）都將永久性地被報告基因蛋白所標記。

目前，已經有多種雙同源重組報告系統被構建，可多方式地對靶細胞進行標記，進行更精確的譜系示蹤研究。例如R26：：FLAP，RC：：Fela，R26NZG，RC：：RLTG，IR1，NR1，R26-TLR等，可在體內同時標記更精確的兩種細胞群。在以往的雙同源重組系統中，由於兩種重組酶識別位點的排列方式是相間排列或嵌套排列，其兩種報告基因的表達會彼此影響，無法各自獨立表達。而且它們無法在體內同時標記更多的細胞群。在器官發育或組織再生中，一種細胞可能有多種發育起源，例如在心臟發育中，其成纖維細胞、脂肪細胞、周細胞、冠狀動脈內皮細胞起源於心臟心內膜細胞和心外膜細胞。同時，一種

幹細胞

可能會分化為多種細胞類型，例如小腸隱窩Lgr5+

幹細胞

能分化為潘氏細胞、杯狀細胞、腸內分泌細胞及腸上皮細胞等各種小腸特化細胞。因此，構建一種新的具有在體內同時對多種細胞群進行標記能力的雙同源重組系統將對發育和再生生物學研究具有重要意義。

為了解決這一問題，研究人員基於Dre-rox和Cre-loxP同源重組酶系統，構建了一種新的雙同源重組報告系統，稱為R26-TLR（Rosa26-traffic light reporter）。R26-TLR的具體結構為Rosa26-CAG-rox-Stop-rox-Zsgreen-insulator-CAG-loxP-Stop-loxP-tdTomato。當發生Dre-rox重組後，ZsGreen基因會表達，而發生Cre-loxP重組後tdTomato基因會表達。ZsGreen和tdTomato的表達能夠受獨立的重組事件調控而不會相互影響。當一個細胞同時表達Dre和Cre重組酶時，這個細胞會同時發生Dre-rox和Cre-loxP重組而同時表達ZsGreen和tdTomato。所以這個系統可對三種細胞群進行同時標記示蹤。研究人員進一步利用Sftpc-DreER；Scgb1a1-CreER；R26-TLR三基因型小鼠進行體內驗證。Sftpc是肺臟II型肺泡上皮細胞（AT2 cell）的分子標記，Scgb1a1是支氣管棒狀細胞（club cell）的分子標記。Sftpc+Scgb1a1+雙陽性支氣管肺泡

幹細胞

（BASCs）位於支氣管和肺泡交界處（BADJs），是一群新發現的多潛能肺上皮

幹細胞

。對以上三基因型小鼠進行Tamoxifen誘導後，收取肺臟組織進行免疫螢光分析，證實了R26-TLR特異性地在體內同時將Sftpc+ II型肺泡上皮細胞標記成ZsGreen+tdTomato– 綠色螢光，將Scgb1a1+ 棒狀細胞標記成tdTomato+ZsGreen–紅色螢光，將Sftpc+Scgb1a1+ BASCs標記成ZsGreen+tdTomato+黃色螢光。進一步對肺臟進行損傷，發現可同時示蹤這三種細胞群的在肺損傷修復中的不同響應情況。發現在萘（Naphthalene）誘導的支氣管上皮損傷修復過程中，tdTomato+ZsGreen– 示蹤的棒狀細胞主要負責再生遠離支氣管末端的棒狀細胞和纖毛細胞，而ZsGreen+tdTomato+示蹤的BASCs負責再生支氣管末端的棒狀細胞和纖毛細胞。在博來黴素（Bleomycin）誘導的肺泡損傷後，ZsGreen+tdTomato– 示蹤的II型肺泡上皮細胞負責修復再生遠離BADJ的肺泡上皮，而ZsGreen+tdTomato+示蹤的BASCs負責再生BADJ附近區域的肺泡上皮。總結來講，R26-TLR可在體內同時標記三種細胞群，為發育、疾病和再生研究提供了新的研究工具。(

生物谷

Bioon.com）

相關焦點

  • 周斌研究組構建雙同源重組報告系統可同時在體內對三種細胞群進行...
    該研究基於Dre-rox和Cre-loxP雙同源重組系統，構建了一種新的雙同源重組報告系統，可以達到在體內同時標記示蹤三種細胞群。這一研究為新型雙同源重組報告系統的構建提供了新的思路，進一步擴充了雙同源重組報告系統庫，並為發育、疾病和再生研究提供了新的技術選擇。
  • ...組構建雙同源重組報告系統可同時在體內對三種細胞群進行標記示蹤
    該研究基於Dre-rox和Cre-loxP雙同源重組系統，構建了一種新的雙同源重組報告系統，可以達到在體內同時標記示蹤三種細胞群。這一研究為新型雙同源重組報告系統的構建提供了新的思路，進一步擴充了雙同源重組報告系統庫，並為發育、疾病和再生研究提供了新的技術選擇。
  • 看懂質粒圖譜,學會同源重組構建質粒
    點擊上方「TUST微生態與分子藥理實驗室」關注我們載體構建(vector construction)是分子生物學研究常用的手段之一。目的是尋找一種能進入細胞、在裝載了外來的DNA片段後仍能照樣複製的運載體，將DNA分子運送到受體細胞中去。
  • 雙鏈DNA同源重組與修復研究
    雙鏈斷裂的DNA能夠以其同源染色體為模板，通過同源重組的方式修復，這一過程對DNA複製、DNA損傷的修復及減數分裂中重組和同源染色體分離等有重要作用。
  • 同源重組基因敲除技術
    接下來就是同源重組技術了。本來是想由我的三位萌新師弟寫，我負責匯總。收上來後發現不是那麼回事兒。在此公開點名一下我們的豹豹童鞋，作為小組稻瘟菌研究的唯一男孩子（不包括畢業生哈）。想著ATMT是他現階段主要用到的實驗步驟，沒想到收上來的竟然是copy的，還是植物。。。只能我依靠記憶寫了（大神勿噴）。
  • 王宏偉研究組合作在線發文揭示DNA同源重組分子機制
    王宏偉研究組合作在線發文揭示DNA同源重組分子機制清華新聞網12月15日電 12月12日，清華大學生命科學學院王宏偉課題組合作在《自然結構和分子生物學》（Nature Structural & Molecular Biology）雜誌在線發表題為《催化DNA鏈交換的人源重組酶RAD51
  • RNA為模板 首次實現植物同源重組修復
    科技日報北京3月19日電 (記者瞿劍)中國農科院作物科學研究所作物轉基因技術與應用創新團隊與美國加州大學聖地牙哥分校合作，使用核糖核苷酸(RNA)作為同源重組修復(HDR)的模板，成功獲得後代無轉基因成分的抗ALS抑制劑類除草劑水稻植株。
  • 進展 | 單分子研究揭示DNA同源重組中鏈交換擴展的分子機理
    基因的同源重組是由重組酶介導的、發生在相同或相近的兩條DNA鏈之間的鏈交換，對於維持遺傳穩定性和生物多樣性具有重要意義。同源重組現象的發現已有幾十年歷史，同源識別和鏈交換是同源重組過程中最重要的步驟，但由於其反應中間產物停留時間短並且狀態複雜，常規方法難以捕捉，因而其分子機理仍十分模糊。
  • 進展|單分子研究揭示DNA同源重組中鏈交換擴展的分子機理
    同源重組現象的發現已有幾十年歷史，同源識別和鏈交換是同源重組過程中最重要的步驟，但由於其反應中間產物停留時間短並且狀態複雜，常規方法難以捕捉，因而其分子機理仍十分模糊。最近，中國科學院物理研究所/北京凝聚態物理國家研究中心軟物質實驗室SM4組的徐春華副研究員、陸穎副研究員以及黃星榞博士等，運用單分子磁鑷和螢光成像技術，通過巧妙的實驗設計，捕捉到同源重組鏈交換的中間態，在體外再現了鏈交換的步進過程，並推測出過渡態結構的存在，建立了RecA介導的同源重組的行波模型，闡述了同源重組中序列識別和鏈交換的分子過程。
  • PNAS:浙大解析同源重組修復機制
    來自浙江大學生命科學研究所的研究人員揭示了一種在同源重組修復中起重要作用的蛋白SPIDR/KIAA014，相關論文「Scaffolding protein SPIDR/KIAA0146 connects the Bloom syndrome helicase with homologous recombination repair」發表在3月18
  • 基因日籤【20210207】適合於實驗系統的重組途徑(內含第15章同源重組與位點專一性重組小結)
    DNA的雙鏈斷裂會引發重組。斷裂點先擴大為一個含單鏈末端的缺口，然後，游離單鏈末端與等位基因序列形成異源雙鏈體。校正事件可發生在異源雙鏈體DNA錯配的位點。發生斷裂的DNA實際上摻入了它所入侵的染色體序列，因此起始DNA被稱為受體。重組熱點是指雙鏈斷裂起始的位點。基因轉換的頻率梯度由一段接近游離末端的序列轉換為單鏈的可能性所決定；離斷裂位點越遠，梯度越下降。
  • 科學網—科學家以RNA為模板首次在植物中實現同源重組修復
    本報訊（記者李晨）日前，中國農業科學院研究人員與美國加州大學聖地牙哥分校合作，使用RNA作為同源重組修復的模板，並分別利用核酶自切割和具有
  • PLoS Genet:祝寬等同源重組保障機制研究中取得新進展
    減數分裂過程中，同源染色體重組是一複雜而又關鍵的生物學過程，由於基因組中存在著很多不同類型的重複序列，如何保障重組僅發生在等位的同源序列之間，而避免發生在非等位的同源序列之間，對於這種同源重組的保真機制目前還缺少直接證據與合理解釋。
  • 科研人員解析同源重組保障的新機制
    減數分裂過程中，性母細胞會主動產生DNA雙鏈斷裂（double-strand break, DSB），起始同源重組。
  • 日本科學家團隊利用水稻稻瘟菌開發了同源重組基因編輯系統
    日本科學家團隊利用水稻稻瘟菌開發了同源重組基因編輯系統 微信公眾號「中國農業轉基因管理」 2019-07-02 17:57
  • 同源重組缺陷在不同腫瘤中的普遍性 --記Caris生命科學公司在2017年ASCO大會上的主題報告
    大通福克斯美國會診中心（CMAA）獨家合作夥伴——Caris生命科學(Caris Life Sciences) 作為腫瘤領域的國際業界領袖參與本次大會，並做了主題為「同源重組缺陷在不同腫瘤中的普遍性」的報告。 ASCO（American Society ofClinical Oncology，美國臨床腫瘤學會）是全球領先的腫瘤專業學術組織。
  • Cell Research:童明漢研究組合作揭示減數分裂同源重組命運決定的...
    與之前PRDM9決定DSB熱點研究不同，該文提出PRDM9及其介導的H3K4me3協同局部染色質環境可能參與了DSB修復過程，與同源重組命運決定相關；發現早期生成的DSBs更傾向於修復形成交叉。本文不僅為同源重組命運決定和交叉穩態的調控研究提供了新視角，也證實了遺傳物質交換機制和表觀遺傳調控的相關性。
  • 從同源重組到鹼基編輯器 看基因編輯72變
    （原標題：從同源重組到鹼基編輯器 看基因編輯72變）
  • 研究揭示發育過程中心臟瓣膜間充質細胞的起源及動態變化
    該研究首次基於Nigri-nox同源重組構建轉基因工具小鼠，並利用Nigri-nox和Cre-loxP系統構建了更為精準的雙同源重組系統，具有能夠在體內同時標記並示蹤兩群獨立的幹細胞群能力，並利用此新系統揭示了心臟瓣膜間充質細胞的起源及動態變化。Nigri-nox系統與傳統的Cre-loxP系統相結合在體內的成功應用為發育、疾病和再生研究提供了更多的技術選擇。
  • Nature:PRDM9在同源重組中的作用
    同源重組是發生在雌雄配子減數分裂過程中的重要事件，在這一過程中，來自父本和母本的同源染色體之間發生遺傳物質的交換，並穩定遺傳給下一代。近期研究認為，哺乳動物細胞的同源重組與一種叫做PRDM9（PR domain containing 9）的組蛋白H3甲基轉移酶的活性有關。