進展 | 單分子研究揭示DNA同源重組中鏈交換擴展的分子機理

基因的同源重組是由重組酶介導的、發生在相同或相近的兩條DNA鏈之間的鏈交換，對於維持遺傳穩定性和生物多樣性具有重要意義。同源重組現象的發現已有幾十年歷史，同源識別和鏈交換是同源重組過程中最重要的步驟，但由於其反應中間產物停留時間短並且狀態複雜，常規方法難以捕捉，因而其分子機理仍十分模糊。

最近，中國科學院物理研究所/北京凝聚態物理國家研究中心軟物質實驗室SM4組的徐春華副研究員、陸穎副研究員以及黃星榞博士等，運用單分子磁鑷和螢光成像技術，通過巧妙的實驗設計，捕捉到同源重組鏈交換的中間態，在體外再現了鏈交換的步進過程，並推測出過渡態結構的存在，建立了RecA介導的同源重組的行波模型，闡述了同源重組中序列識別和鏈交換的分子過程。

作為重組酶的代表，RecA幾乎能夠獨立完成同源重組中的鏈交換過程。RecA介導的同源重組可簡略描述為：發生雙鏈斷裂的DNA末端在相關蛋白的作用下，形成3¹單鏈突出，這段單鏈可以被RecA纏繞形成螺旋絲狀結構（核蛋白絲nucleoprotein filament）;核蛋白絲入侵到雙鏈DNA中，搜尋與之同源的序列並發生鏈交換。核蛋白絲中的入侵鏈(I鏈)替換同源雙鏈DNA中的被替換鏈(O鏈)，與互補鏈(C鏈)形成新的雙鏈，如圖1A左圖所示。在本研究中，研究人員使用發卡結構DNA（hairpin DNA）與RecA形成的核蛋白絲來模擬同源重組的擴展過程，如圖1A右圖所示（虛線框內部分與左圖虛線框相對應），核蛋白絲在發卡DNA開口處發生鏈交換，每一步打開一定數量的鹼基對，體現為磁球高度的步進式變化，以此在體外再現鏈交換的步進過程。

在研究中，他們意識到鏈交換反應的中止或許能夠體現出中間態的信息，從而得到更多鏈交換反應的細節。因此，研究人員設計了一系列包含不同錯配鹼基的DNA，從單分子尺度上觀察鏈交換反應的動力學現象。他們意外地發現鏈交換的終點竟然不在界面（錯配序列與同源序列的交界處定義為界面），而是被完全錯配序列阻擋於界面之前9 bp的位置（圖1B和C）。

圖1.用單分子磁鑷觀察鏈交換反應。（A）使用120 bp的發卡DNA來模擬供體雙鏈DNA。（B）鏈交換反應的典型曲線，部分序列為錯配鹼基。（C）鏈交換反應長度的分布。藍色點劃線表示界面的位置，紅色虛線表示界面前9 bp的位置。

邏輯上講，同源序列比對過程應發生在鏈交換反應之前，且必然越過界面，否則核蛋白絲無從得知界面後的DNA序列是否同源。因此在界面前9 bp到界面之間的9個同源鹼基也應被比對過。那麼，為什麼這9個鹼基沒有發生鏈交換反應？這個結果暗示了鏈交換反應中，在序列比對態與已換鏈態之間存在著一個9 bp的過渡結構。由於這個結果過於意外，研究人員用酶切保護實驗和螢光共振能量轉移（FRET）實驗（圖2）兩種方法進行了進一步證實。此外，FRET實驗提供了雙鏈DNA結構的重要的信息，未參與反應的雙鏈DNA會以接近垂直的角度從核蛋白絲中彎折出來。

圖2.使用FRET實驗研究鏈交換反應。（A）實驗示意圖。當反應結束時雙鏈DNA從核蛋白絲中彎折出來。藍色點劃線表示界面的位置，紅色虛線代表界面前9 bp的位置。（B）左側為典型的FRET實驗曲線，後18個鹼基為完全錯配序列。右側展示的為是終態FRET值的統計分布。（C）與（B）相同，後18個鹼基為50％錯配序列。

通過磁鑷和FRET實驗，研究人員還測量了鏈交換和同源序列比對的步長，他們發現雖然3 bp仍然是鏈交換的基本單位，但同源序列比對與鏈交換的步長都更傾向於以3 bp的整數倍發生，最概然的步長均為9 bp。同時，前面提到的過渡結構也為9 bp。結合實驗和理論，研究人員建立了一個鏈交換模型，在這個模型中鏈交換過程像行波一樣推進：在最前端，雙鏈DNA會以9 bp為步長與核蛋白絲中的單鏈進行同源序列比對，後面緊跟著一個9 bp的過渡態，最後則是已經發生鏈交換的雙鏈DNA，反應模型如圖3所示。

圖3.同源重組過程的步驟分解。（A-D）同源序列間的鏈交換過程，C鏈分為3個部分，已換鏈態（紅色），過渡態（藍色）以及序列比對態（綠色）。（E-H）同源重組過程被非同源序列阻擋的情況。同源比對態跨過界面位置。I鏈的同源序列表示為黃色，非同源部分為黑色。核蛋白絲上的RecA蛋白為了展示方便而隱去。

該工作以「Mismatch sensing by nucleofilament deciphers mechanism of RecA-mediated homologous recombination」為題，發表於Proc. Natl. Acad. Sci. USA（DOI：10.1073/pnas.1920265117）。此工作得到了國家自然科學基金、中國科學院前沿科學重點研究計劃、中國科學院青年創新促進會以及王寬誠教育基金的支持。文章連結

編輯：米老貓