王忠良Chem.Soc.Rev.最新綜述:高性能螢光和生物發光RNA成像探針的...

原標題：王忠良Chem.Soc.Rev.最新綜述：高性能螢光和生物發光RNA成像探針的最新進展

【引言】

RNA在生物的生命活動中起著重要作用。信使RNA（mRNA）和微型核醣核酸（miRNA）的成像不僅能夠學習mRNA的形成和轉錄以及參與各種生命過程的miRNA的生物合成，而且有助於檢測癌症。高性能RNA成像探針大大擴展了人們對生命過程的看法，增強了癌症檢測的準確性。

近日，來自西安電子科技大學的王忠良教授、中國科學院田捷研究員、美國國立衛生研究院的陳小元研究員（共同通訊）等人總結了最先進的高性能RNA成像探針，包括可以對具有特殊修飾的RNA序列成像的外源探針和可直接成像而無需特殊處理的內源性探針，並對每個探針都詳細地論述了其結構和成像原理。此外，還總結了mRNA和miRNA成像探針在研究生命過程以及檢測癌症中的應用。上述內容以「Recent advances in high-performance fluorescent and bioluminescent RNA imaging probes」為題發表在了2017年3月27號的Chemical Society Reviews上。

綜述總覽圖

1 簡介

RNA在基因表達和調控中起重要作用。對於基因表達，mRNA是模板，而tRNA和rRNA分別是胺基酸和催化劑的轉運蛋白。 對於基因調控，siRNA（小幹擾RNA），miRNA和shRNA（短髮夾RNA）可以以不同的方式調節基因表達。學習基因表達和調控不僅增加了對各種生命過程的了解，而且有助於疾病診斷和治療。

基因表達和調控的可視化可以通過各種成像RNA（主要是mRNAs4和miRNAs）來實現。mRNA在基因表達和調控中起著核心作用，因此學習轉錄、定位、轉運、翻譯可以獲得大量關於基因表達的信息。miRNA是控制mRNA基因表達的內源性調控RNA，因此miRNA的成像可以獲得相應mRNA的基因調控信息。

RNA成像探針可以分為兩種類型：探針成像外源RNA和成像內源RNA的探針。它們在結構和原理上有很大的不同，在前一種類型的RNA成像探針中，靶向RNA不是天然的內源性RNA，而是外部插入某些蛋白質結合序列的RNA。成像探針與插入的RNA序列（除了染色表達序列）特異性相互作用使得靶向RNA發光。目前，成像外源RNA的探針包括RBP-FP（RNA結合蛋白 - 螢光蛋白）系統，雙分子螢光互補（BiFC），RNA適配體/螢光團系統和報告基因系統。在後一類型的RNA成像探針中，內源性RNA是天然內源性RNA，並且在成像之前不需要額外的預處理。

圖1 各種外源和內源RNA成像探針結合靶向RNA的圖解說明

2 探針成像外源RNA

外源RNA是外部插入某種蛋白質結合序列，染料結合序列或染料表達序列的RNA。目前，成像外源RNA的探針可分為RBP-FP系統，雙分子螢光互補（BiFC）系統，RNA適配體/螢光團系統和報告基因系統四種。對於RBP-FP系統，成像探針與插入的蛋白質結合序列特異性相互作用，然後照射靶向RNA。對於BiFC，成像探針被分為兩個非螢光部分，並且與相同靶向RNA中的兩個不同的插入的蛋白質結合序列相互作用。只有當成像探頭的兩部分準確重合時，BiFC探針才會照亮靶向RNA，並且具有比RBP-FP系統低得多的背景信號。對於RNA適配體/螢光團系統，成像螢光團直接與插入的RNA適體（染料結合序列）相互作用並照射靶向RNA。該系統的成像速度比RBP-FP系統和BiFC系統快得多，因此可以用於實時成像。對於報告基因系統，插入的染料表達序列可以表達螢光團（如GFP）或螢光素酶。插入報告基因的3 UTR後，調節miRNA可以間接成像。由於所有這些探針必須與其相應的RNA合作進行適當的預處理，因此它們被分類為成像外源RNA的探針。

2.1 RNA結合蛋白 - 螢光蛋白系統（RBP-FP系統）

RBP是可以特異性結合MBS（MS2結合序列，RNA序列）的MS2外殼蛋白（MCP）。為了對目標mRNA進行成像，將mRNA在3'-UTR（非轉譯區）中進行預處理來包含 MBS 的6個單元，然後將MCP-GFP融合蛋白加入預處理的mRNA細胞中。MCP-GFP融合蛋白然後結合靶向mRNA並照射靶向mRNA。利用該系統，可以追蹤活體酵母中ASH1 mRNA 的定位和轉運。

圖2 RBP-FP系統的結構

2.2 雙分子螢光互補系統

為了減少來自RBP-FP系統的背景信號，將雙分子螢光互補（BiFC）併入RNA成像中。在BiFC中，FP分為兩個互補的非螢光部分：N端FP（N-FPs ）和C端FP（C-FP）。 由於N-FP和C-FP都不是帶有螢光性的，所以游離蛋白質的背景信號變得可以忽略不計。

2.3 RNA適配體/螢光系統

將RNA適配體預插入目標RNA的3'-UTR中，與不存在靶向RNA時相比，螢光團的螢光在靶向RNA的存在下顯著增加。RNA適配體/螢光團系統利用的是適配體 - 螢光團的相互作用，而不是RBP-FP系統或BiFC系統中RNA-RBP的相互作用。適配體和小分子螢光團之間的結合是快速的，因此該系統實現了實時成像。在該系統中，照射RNA適體可以大大增強螢光團的螢光。目前研究最多的螢光團是二氟-4-羥基亞苄基咪唑啉酮（DFHBI），它是模仿eGFP結構的商業染料。

圖3 RNA適配體/螢光團系統的不同結構

2.4 報告基因系統

報告基因系統專門用於miRNA成像。 通常21-25個單鏈RNA的miRNA是作為控制各種基因調節的序列調節器。 因此，報告基因系統主要應用於成熟miRNA功能的成像，雖然還研究了pri-miRNA（初級miRNA）轉錄，pri-miRNA切割，ds-miRNA和不穩定mRNA或抑制靶向基因的miRNA功能的成像，但是本文主要討論了單一成像報告基因系統的miRNA功能。

圖4 報告基因系統的結構

3 探針成像內源性RNA

與成像外源RNA的探針不同，成像內源RNA的探針不需要將某些RNA序列引入靶向RNA或轉錄報告基因。它們含有識別序列，並通過鹼基配對互補形成內源RNA。在本文中，作者主要介紹了FISH探針，納米MB和無猝滅探針。FISH探針通常是用螢光團標記的ssDNA或ssRNA，並且由於存在大量探針而能夠以高解析度成像的靶向RNA。MB是具有莖環結構（或β-髮夾結構）的ssDNA或ssRNA，其中螢光團和猝滅劑位於莖部分，識別序列位於環區。 MB在莖環結構上不產生螢光，但在靶向RNA存在下會產生螢光，因此，MB探針也具有較低的背景信號。 MB不能自己進入細胞，因此對於活細胞成像，需要基因載體來遞送探針。無猝滅探針是含有特殊螢光團的ssDNA或ssRNA，其在ssDNA或ssRNA結構中是非螢光性的，但在DNA / RNA雙鏈體或dsRNA結構中具有螢光性。

3.1 FISH探針

FISH技術始於在20世紀80年代，最初是用於基因組成像。用於RNA成像的FISH探針是帶有相同螢光團標記的ssDNA，ssRNA或混合ssRNA / DNA序列組，其序列與靶向RNA的不同部分互補。由於FISH探針是在不存在靶向RNA的情況下具有螢光性的，所以如果游離的FISH探針未被去除，背景信號將會很高。 因此，FISH探針只能在處於預處理的固定細胞中成像RNA，並且可以除去游離的FISH探針。

3.2 分子信標（MBs）

分子信標是用於RNA成像研究最多的探針。它們具有莖環DNA結構，識別序列位於環區。在莖區域，螢光團和猝滅劑處於非常接近的位置，首先導致MBs失去螢光性能。然而，一旦MBs暴露於靶向RNA，識別序列將與靶向RNA形成穩定的雜交雙鏈體，並且莖-環結構將變成線性的，迫使猝滅劑遠離螢光團，從而恢復螢光性。

圖5 MBs的不同結構

3.3 納米MBs

納米MBs是指加載納米顆粒的MBS，用其作為猝滅劑和載體，並且不需要額外的基因載體來遞送探針。這裡的納米顆粒不僅僅是MBs的載體，而且還作為MBs上相鄰螢光團的猝滅劑。

圖6 不同納米MBs的結構

3.4 無猝滅探針

與MBs和納米MBs不同，無猝滅探針不需要猝滅劑來減少探針的初始背景螢光。 相反，這些無猝滅探針中的螢光團自身被淬滅。FIT探針和ECHO探針是典型的無猝滅探針。

4 RNA成像的應用

4.1 應用於追蹤RNA過程

mRNA過程通常包括轉錄，定位，轉運和翻譯，通過跟蹤新生RNA，顯示強表達的持家基因在RBP-FP系統開發期間改變了轉錄脈衝的大小。通過用RBP-FP系統跟蹤先前得mRNA，在活細胞中監測剪接體裝配的動力學過程。通過用兩組不同的FISH探針標記GFP前mRNA的外顯子和內含子，將162個剪接過程用單分子靈敏度就達到可視化。

圖7 成像應用於追蹤RNA過程

4.2 癌症診斷中的應用

對於檢測單個mRNA腫瘤標記物，MBs和納米MBs已經成功應用於檢測不同腫瘤細胞中的存活蛋白mRNA，MnSOD mRNA，c-raf-1 mRNA，TK1 mRNA，STAT5B mRNA126和K-ras mRNA170。多個mRNA腫瘤標記檢測可以提高癌症檢測的準確性，這可以很容易地被納米MBs完成。

圖8 在CLSM下的TK1 mRNA，存活蛋白mRNA，c-myc mRNA和GalNAc-T mRNA的細胞成像

【總結與展望】

RNA成像在以下兩個方面非常重要。 首先，RNA成像可以跟蹤RNA過程，如轉錄，定位，轉運和翻譯。其次，RNA成像可用於癌症診斷，因為某些mRNA或miRNA可以作為腫瘤標記物。 然而，RNA成像目前主要停留在細胞水平，體內成像非常罕見。本文總結了目前的高性能RNA成像探針，分析了其結構和成像原理，並將設計與其應用相關聯，這可為將來優化電流探針提供指導。

文獻連結：Recent advances in high-performance fluorescent and bioluminescent RNA imaging probes（Chem.Soc.Rev.,2017,DOI: 10.1039/C6CS00675B）

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