Sensor. Actuat. B-Chem.|基於磷取代羅丹明近紅外螢光探針對體內內源性次氯酸的深度成像

2021-01-21 Fluorescence WORLD

一、摘要

精心設計的螢光探針的螢光成像對先天免疫系統複雜活動的無創口分析具有重要意義，同樣也迫切需要具有深度組織穿透能力的螢光分子結構來進行生物體內的螢光成像。本文研究者設計了最大激發波長在730nm處的磷取代羅丹明螢光探針PR-HOCl，對HOCl（檢測限，10 nM）表現出快速響應（20s）和較高的選擇性，並在體外具備較寬的線性範圍（0.15 uM-13.5 uM）。在活的小鼠單核巨噬細胞白血病細胞中，探針PR-HOCl可對內源性和外源性的次氯酸靈敏檢測並具較高的選擇性，並在炎症裸鼠模型中對內源性次氯酸進行螢光成像，證明了PR-HOCl具備穩定的組織穿透能力。

二、背景

隨著螢光成像技術的進步，可追溯至螢光成像發展初期的有機螢光探針，由於其易變結構，可用於構建所需特性的螢光團，引起越來越多人的關注。在應用螢光團過程中，螢光分子必須具備良好的光穩定性，生物相容性，溶解度，摩爾吸光係數和螢光量子產率，在大量的螢光體系中，羅丹明就具備上述的光化學性質，並作為分子骨架廣泛應用於新型螢光團的設計。

許許多多的實例證明，矽取代的羅丹明分子相較於氧取代類似物，光譜會產生大約90nm的紅移，磷取代的羅丹明分子由於HOMO和LUMO軌道之間縮小的能隙，光譜相較於氧取代會產生約140nm的紅移，紅移光譜的產生就確保了此類螢光團具備應用於體內無創深度生物成像的前景。此外，磷取代後的羅丹明分子還具備卓越的溶解度和光穩定性。

最近幾年，活性小分子如活性氧（ROS）和活性氮（RON）由於其在生物體內生理和病理調控功能中的顯著作用，吸引了大量的關注。ROS的過度表達與許多疾病相關，並且各種各樣的ROS參與了病理過程，包括H202，NO3-，ONOO-，HOCl等等。HOCl作為最重要的ROS之一，參與了許多細胞過程，包括消炎調控，病原體響應和老化。目前設計和報導了一些用於HOCl螢光成像的探針，但少有可實現體內HOCl深度成像，阻礙了與HOCl相關疾病的診斷和治療分析。

三、主要工作

1.探針PR-HOCl的設計合成

研究者們廣泛接受一種可行的螢光調控規則，通過與分析物反應，調控基於氧雜蒽的螢光團的無螢光螺內醯胺，與具有螢光的開環醯胺之間的平衡，來達到調節螢光的目的。可將羅丹明作為一個典型例子來說明，通過分析物來調控開環過程，將其去螺環化和螺內酯結構作為一個理想分子骨架來進行開啟式螢光生物成像。因此，硫代氨基脲部分可以鎖住螺環來成為無螢光的結構，而與HOCl反應後，形成噁二唑打開螺環，進而發出強螢光。此外，用磷取代橋接氧，可使吸收和螢光光譜產生明顯的紅移，具有羅丹明結構的優點。（Scheme 1 and Scheme 2）

2.PR-HOCl的光譜性質

在NaClO存在下，於PBS緩衝液（pH=7.4）中測試PR-HOCl的光譜性質，最大吸收波長（λabs）為710nm，最大發射波長（λem）為730nm（Figure 1a and b），並且摩爾消光係數為417 M-1cm-1。PR-HOCl與次氯酸反應生成螢光物質PR，以Cy 5為參照，該螢光物質在PBS緩衝液中的量子產率（Ф）為0.12。當NaClO的濃度升高，PR-HOCl的吸收和螢光強度隨之增強，當NaClO的濃度大約為600 uM時，PR-HOCl的螢光強度升高20倍，當濃度再增大，螢光強度未見明顯改變，螢光強度與NaClO的濃度在0.15-13.5 uM範圍內存線性關係（Figure 1c）。經計算，PR-HOCl的檢測限（LOD=3σ/slope，σ是標準偏差）為10 nM。

3.PH的影響

不存在NaClO的情況下，隨著pH從5變到8，PR-HOCl的螢光強度變化很小（Figure 1d），滿足在生物體內進行螢光成像的需求。在酸性條件下（pH＜5.0），PR-HOCl部分開環，小幅度提升了螢光強度，而鹼性條件下（pH＞8.0），隨pH數值增大，螢光強度降低。

4.PR-HOCl的專一性和選擇性

選幾個常見的活性氧（ROS）和活性氮（RON）分別來評估在檢測ClO-時PR-HOCl（5.0 uM）的專一性和選擇性，由圖所示，這些活性氧和活性氮包括•OH，H2O2，NO3−，NO2−，ONOO−，t-BuOO•和t-BuOOH，觀測到在這些活性氧和活性氮存在時，PR-HOCl在730nm的螢光強度幾乎沒有改變，加入NaClO（15 uM）後，螢光強度顯著增強，證明了其對ClO-具選擇性（Figure 2a）。

5.檢測動力學

用不同濃度NaClO（0.15 uM，7.5 uM，45 uM）來探究PR-HOCl（5.0 uM）的檢測動力學。PR-HOCl與不同濃度的NaClO混合，其螢光強度在約20秒內達到平臺，證實了PR-HOCl與ClO-的反應非常迅速（Figure 2b）。本文研究者還全面比較了近期發表的8個不同螢光探針對ClO-的檢測情況（Table S1）。

Table S1. Comparison of FluorescentProbes for HOCl

6.內源性和外源性HOCl在小鼠單核巨噬細胞白血病細胞中的成像

研究者更進一步探究PR-HOCl在生物體內的情況。在PR-HOCl（0.1-10 uM）存在下，通過溴化噻唑藍四氮唑還原法（MTT）孵化HeLa細胞來評估孵化24h後PR-HOCl（0.1-10 uM）的細胞毒性。由圖，在PR-HOCl濃度低於10 uM時，細胞毒性可忽略不計（Figure S1）。通過紫外輻射PR-HOCl的水溶液2小時並未觀察到明顯的螢光衰減，同樣也證實了其卓越的光穩定性（Figure S1）。

接下來用PR-HOCl在生物體內檢測外源性和內源性HOCl。在用5.0 uM PR-HOCl孵化小鼠單核巨噬細胞白血病細胞系（RAW 264.7 cell lines）後，再用不同濃度的NaClO孵化細胞，隨著NaClO的濃度提高，細胞系的螢光強度也隨之增強（Figure 3b）。通過結合LPS和PMA來刺激內源性HOCl（Figure 3a）的生成，與沒有加入PR-HOCl（control experiment）以及只加入PR-HOCl的細胞系相比，在加入刺激試劑後，細胞系螢光強度顯著增強。ABH可以降低細胞中的HOCl濃度，因此往另一組細胞中加入PR-HOCl，LPS/PMA和ABH，觀測到非常微弱的螢光，證明了PR-HOCl可在生物體內精確識別內源性和外源性HOCl。

研究者同樣探究了PR-HOCl在體內的光穩定性。分別評估經PR-HOCl（5.0 uM，加入100 uM NaClO）和Cy5染色的RAW 264.7細胞的螢光強度，在持續5min雷射照射下，PR-HOCl染色的細胞系螢光強度無衰減，而Cy5顯著降低（Figure 4 和 Figure S3）。

7.肝臟組織的螢光成像

研究者收集了用PR-HOCl和NaClO預處理的BALB/c裸鼠肝組織切片的螢光圖像，Z掃描共聚焦成像顯示，當成像深度達到110μm時，NIR螢光信號仍可檢測到（FigureS2）。

8.炎症裸鼠模型中HOCl的深度螢光成像

與空白組（只注射salen）和對照組（只注射PR-HOCl）相比，工作組中的小鼠（已注射LPS，PMA和PR-HOCl）在腹膜腔內檢測到強發光（Figure 5a）。通過重建算法（擴散發光層析成像，DLIT）程序，進一步對小鼠進行三維螢光成像，以估計螢光發光的深度。 將三維螢光圖像與三維微CT圖像共定位以顯示螢光的位置（Figure 5b）。

四、總結

在生物學研究中迫切需要分子螢光探針在動物體內進行深入，無創的體內成像。因此，本文研究者通過以磷取代羅丹明中的橋接氧原子，開發了一個新型的近紅外螢光探針，其最大吸收/發射波長約在710/730nm，用該探針來進行體內的次氯酸開啟式螢光成像，所獲結果證實了其具有可靠的光穩定性，溶解性，快速響應（20s），較低的檢測限（10nM），生物相容性，螢光量子產率以及組織穿透能力，並由於該探針在檢測次氯酸離子時表現出來的穩定的選擇性和超快的動力學，已經將其成功應用於在活的小鼠單核巨噬細胞白血病細胞系中對內源以及外源性次氯酸離子的螢光成像。此外，在BALB/c炎症裸鼠中對內源性次氯酸離子的三維螢光成像證實了磷原子橋接的羅丹明分子結構在對生物系統內概括性目標的深度成像具有廣闊的前景。

文章引用 DOI: 10.1016/j.snb.2019.127652


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