【論文故事】諾獎團隊再下一城:給細胞拍高清小電影

自16世紀末羅伯特·胡克（Robert Hooke）發明第一臺顯微鏡起，光學設備的革新就一直在推動生命科學的發展。能實時、實地看見生物體中最細微的動態變化一直是不少生物學家夢寐以求的「超能力」——而有了顯微鏡，這種能力將不再遙不可及。今年諾貝爾化學獎的得主之一，霍華德·休斯研究所的艾力克·貝齊格（Eric Betzig）和他帶領的研究團隊便是這樣一群追夢人。

繼2006年在《科學》上發表文章之後，研究小組於10月24日再次在《科學》上發表了他們的最新進展：新型晶格層光顯微鏡（lattice light-sheet microscope）在突破衍射極限的基礎上，還能拍攝連續的高清動態3D視頻——從細胞分裂時的骨架變化，到線蟲發育的細節，細胞的「小動作」們在各種時空下一覽無餘。

2014年10月24日的《科學》封面：成像創新。圖中為斑馬魚胚胎活體中的腦神經元成像。圖片來源：Kai Wang, Eric Betzig, Janelia Research Campus; Jeff Mumm, Johns Hopkins University

要達到超越阿貝極限（0.2μm）的高解析度，往往需要多束光由點及線再到面的細細雕琢；可是這麼一來，研究者在獲得清晰度的同時會犧牲時間和樣品活力。說起拍攝「小電影」的工作難點，論文的第一作者，臺灣應用科學研究中心的陳壁彰這樣告訴果殼網科學人：「從二維到三維，在空間上重要的是軸向解析度，在時間上則需要快，因為我們的觀察對象是活體生物。」三維的景象是不同景深的二維圖像拼接而成，拼接越緊湊，軸向的解析度越高；而要想實時追蹤活體樣品的動態變化，必須儘可能壓縮「拍照」和「疊加」的時間，與生物體賽跑。很長時間內，追求精度和追趕時間似乎無法兩全。

先前，貝齊格發明的光激活定位顯微鏡（PALM）通過單次激發少量稀疏的螢光分子後迅速淬滅，繞過衍射極限，多次重複以獲得高清圖像。而赫爾（Stefan W. Hell）發明的另一種納米顯微鏡，受激發射損耗（STED）顯微鏡則是在傳統探照光束中加入了另一圈淬滅光束，以此提高精度。無論是哪一種，都免不了多束光對樣品的長時間損耗——畢竟每張二維的圖像都是由多個點掃描出的線拼接而成。要想加快速度，不僅需要更快的掃描速度，而且還得有更快的採集方式和數據處理方法。同時，掃描所用的雷射也得更加柔和，以儘量減小對活體樣品的損傷。

研究小組巧妙地利用了貝塞爾光束（Bessel beam）。與傳統的高斯光束（Gaussian beam）不同，根據雷射性質模擬出的貝塞爾光束不會發生衍射；同時，這樣的光束能量更加分散，對樣品更「溫柔」。不過它也存在自己的問題。「（貝塞爾光束）並不只是一束光而已——它有周圍這些暗一些的光圈，」貝齊格在一項訪談說，「於是，當它掃過樣品時，你會得到散焦的光。」

晶格層光顯微鏡用非衍射性的貝塞爾光束（Bessel beam）取代以往的高斯光束（Gaussian beam），根據樣品特性設計出不同的晶格（lattice），不僅更柔和，圖像捕捉和處理的速度都大大加快。A、B分別為高斯光束和貝塞爾光束的光斑，C、D是兩種不同的晶格，E、F、G是顯微探頭的工作示意圖。在圖G中，晶格層光（藍綠色）與細胞（灰色）相交，在單一平面上激發出螢光（橙色）。層光掃過整個細胞，構建三維圖像。圖片來源：研究論文

為了克服這一點，研究小組利用了結構化照明（structured illumination）技術。通過事先設計好的照明結構，研究者們能夠在後期通過計算程序抹去焦點外的「馬賽克」。「有了這個技術，我們不僅能把副光圈產生的模糊像去掉，還能將解析度進一步提升到衍射極限之外。」貝齊格說。

「在硬體上，我們需要雷射光源，聲光可調諧濾波器用來選擇入射波長及能量，兩組快速掃描鏡，空間光調製器，兩個光學鏡頭，一些不同焦距的透鏡，及高速相機。而軟體上，主要就是用labview來做所有的系統控制。聲光可調諧濾波器會讓所選擇的波長及能量的雷射通過，經過空間光調製器（上面有我們計算出的晶格樣式），再經過透鏡聚焦後，產生我們的衍射圖樣。」陳壁彰介紹說。這束圖樣經過光罩濾光，再由兩個方向掃描鏡將此相疊後便會在入射鏡頭處形成晶格層光。「這一薄層光照射在有螢光的生物樣品上，發出的螢光會被另一個正相交的鏡頭收集，而所集的螢光就會成像在相機上。」

貝齊格曾表示：「一般來說，當人們做單分子研究時，他們需要將樣品處理得非常薄，否則焦點外的光會毀了整個圖像。」而晶格光片顯微鏡將這些限制也移除了。

「我們產生了一個非常薄層的光，就像紙一樣，」陳壁彰對果殼網科學人說，「因為光層非常薄，所以能採到很高的軸向解析度，取到的三維圖像也愈接近真實的生物體。因為我們的光不是一直照射在樣品上，所以對生物樣品有低光損害，因此可以長時間觀察這些活體生物，也就是四維的影像。」

模式生物嗜熱四膜蟲（Tetrahymena thermophila ）單個樣品在8個連續時間點的三維圖像。整套4D成像數據包括1250個時間點。圖片來源：Betzig Lab，HHMI

有了這臺功能強大的顯微鏡，研究小組通過與30組生物研究團隊的合作，看見了許多前所未見的高清影像——例如，一個蛋白質在細胞內的三維動態，中性粒細胞在三維基質中動態「擠動」的細節，T細胞和靶細胞的「親密接觸」，還有線蟲和果蠅胚胎發育過程中各種細胞的遷移和變化。

人早幼粒白血病細胞HL-60在膠原蛋白基質中遷移的影像。HL-60細胞表達帶有mCherry螢光標記的utrophin蛋白（視頻中綠色部分），膠原蛋白則帶有FITC標記（視頻中橙色部分），視頻由超過250個個時間點數據構成，相鄰兩時間點間隔1.3秒。視頻來源：Betzig Lab，HHMI

 

秀麗隱杆線蟲胚胎在3摺疊期時的快速肌肉抽動影像。視頻中普列克底物蛋白同源結構域（PH domains）帶有綠色螢光蛋白GFP標記，組蛋白帶有紅色螢光蛋白mCherry標記。比例尺為10微米。視頻來源：Betzig Lab，HHMI

「這是我2011年秋天進入貝齊格實驗室的研究題目，」回首項目攻堅過程，陳壁彰說，「老闆當時已有電腦的理論計算的結果，只是如何將這理論的東西變成一個顯微鏡，甚至是生物的顯微鏡，都是未知的。一開始的確是遇到極大困難，我們試了很多種方法，也曾想放棄，後來給了自己最後兩個月的時間，若做不出來就要放棄了。」

「那時的我每天和另一位同事，王凱，也是本篇論文的共同作者，並肩奮鬥：他幫忙做計算，我來驗證實驗上的可行性。在2012年秋天，基本上的架構就已出來了。老闆看到結果時相當開心，我們知道所有的東西都解開了。」陳壁彰回憶道。

「之後的一年多，就是做生物合作，因為老闆告訴我說，生物顯微鏡就是給生物學家拿來應用的，不做生物合作要做什麼？所以我們後來花了大部份的時間做生物。不過同時我也一直在加強顯微鏡的功能。」陳壁彰說。

功夫不負有心人，這臺顯微鏡給生命科學帶來了驚喜和震撼。而研究小組的追夢步伐不會就此止步。「我們目前的主要生物對象是細胞，線蟲的卵或是生物體較表面的東西，」陳壁彰告訴果殼網科學人，「所以如何將所看的東西往更大的方向走，就是我們未來的工作方向。我們就是要看得快、看得小、看得久、看得深。」晶格層光顯微鏡不會成為登峰造極之作，因為未來只會更好。「未來的我想藉由非線性光學往『看得深』及『看得快』的方向前進。」（編輯：Calo）

參考文獻：     

1. Bi-Chang Chen, et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science: 346 (6208)

文章題圖：Kai Wang, Eric Betzig, Janelia Research Campus; Jeff Mumm, Johns Hopkins University