6月13日,河南省疾控中心傳染病研究所及加拿大國家微生物學實驗室的Haiyan Wei和加拿大馬尼託巴大學醫學微生物學系的Jonathan Audet合作在Nature子刊scientific reports雜誌上發表論文,用令人驚訝的精度研究了馬爾堡病毒安哥拉變異株在適應新宿主時的變異。他們的研究發現兩個區域經歷著大量改變,即NP和VP35基因之間的區域和VP40蛋白的前100個胺基酸,也揭示了在病毒適應新宿主時,只有少數區域攜帶大部分的變異,且許多變異在適應的早期就基本固定了的現象。該工作是首次對馬爾堡病毒適應宿主變異的細緻的研究,完善了對馬爾堡病毒與毒力相關基因變異的認識,且為伊波拉病毒的監測提供了新的思路。
The first study of this type filovirus to show a detailed glimpse into the changes which occur during virus adaption to a new host.
These results showed "hot-spots" for adaptation and monitoring of adaptation.
Understand the sequence and frequencies of mutations during adaptation will allow better monitoring of MARV and the related ebolaviruses.
馬爾堡病毒屬於絲狀病毒科馬爾堡病毒屬。該屬包括一個馬爾堡病毒種,它包含兩種病毒:馬爾堡病毒和拉夫病毒(Ravn virus )。馬爾堡病毒從1967年被發現就開始引起絲狀病毒出血熱的爆發,致死率20%到90%。最大且最致命的爆發是在2005年的安哥拉,引起病例252例和死亡227例。它發現於果蝠,是一種動物源性疾病。已從非洲捕獲的果蝠分離出活的複製完全的病毒。近期研究發現兩種病毒及其變異體可以在相同的蝙蝠聚居地流行。
馬爾堡病毒可以引起像伊波拉病毒一樣致死的爆發,應對它的策略,如疫苗和治療方面,還很不成熟。很大程度上因為優良的小動物適應的病毒株的缺失。2014年,作者及團隊研發了一種以安哥拉變異株為基礎的適應了老鼠的馬爾堡病毒,選擇這個變異株是因為它引起了迄今最大最致命的疫情爆發。2016年,他們對該毒株在SCID老鼠上經24次傳代後的肝勻漿和兩次細胞培養物的上清進行深度測序,以觀察病毒適應新宿主時基因組的變異。
研究者通過給新的老鼠注射感染後7天的老鼠的肝勻漿,使病毒適應新宿主。這些勻漿都保存下來,以獲得病毒RNA。他們將第24次傳代後的肝勻漿接種於Vero E6細胞,經兩次傳代,得到病毒儲備物。
通過對傳代24次產物的基因組用3-6kb的6個重疊的片段(以A至F命名)進行擴增,研究者發現某些代的基因及F片段不能被擴增(如圖1.A,紅色為片段已擴增的,藍色為片段不能被擴增的)。
Fig 1.A Summary of the PCR amplifcation
接著,研究者對24份肝勻漿和病毒儲備物的上清進行了核酸提取,RT-PCR,1%瓊脂糖凝膠鑑定,試劑盒純化,擴增子濃縮,文庫構建及MiSeq測序儀(Illumina)的深度測序,結果如圖1.B,Stock是病毒儲備物,高亮的部分為編碼區。
Fig1.B MiSeq sequencing coverage
研究者發現該病毒適應新宿主時經歷了一些變異,共發現54個沉默突變(如圖1.B),其中只有7個在病毒儲備物中還存在。發生了最多變異的VP40蛋白,共出現19個變異,集中於前100個N-末端胺基酸,它的變異開始得很早。糖蛋白(GP)也有大量變異,多在粘蛋白樣結構域,但它的變異沒有一個在病毒群變得主導,且僅在第13到19代檢測到。NP和L蛋白每個有8個變異,到第24代,每個蛋白只有1個變異在病毒群起主導作用。L蛋白從第5代開始積累變異,NP則從第13代開始。VP35有6個變異,5個在前50個N-末端胺基酸,開始於第5代。VP30有6個變異,4個在前100個N-末端胺基酸,所有變異只發現於第16到21代。VP24隻經歷了2個變異,有趣地是,V157M變異出現在第4代且在第7代時變得主導(如圖2)。
Fig 2. Non-silent mutations in coding regions over virus passages in SCID mice
研究者在非編碼區也發現了變異(如圖3)。大部分非編碼區有4個變異或更少,且它們大部分僅存在1代或很少代,也沒有達到病毒群很高的百分比。VP24的3『起始端和非編碼區沒有任何改變。NP非編碼區5』末端有大量變異,共19次,它們大多是成簇地,到第24代變得固定。這些區域外,只有3個變異變得固定或接近固定,分別在VP35,VP40和GP的非編碼區。VP35和VP40對病毒的免疫侵入很重要。近期研究揭示了在西非伊波拉病毒爆發時獲得的序列上,相當於非編碼區的一個相似的變異,致其毒力增加。
Fig 3. Mutations in non-coding regions over virus passages in SCID mice
研究者還發現大量第24代的變異在生產病毒儲備物時丟失,但出現了一些新的突變(如圖4,每個豎線代表一個突變),他們認為細胞培養導致了病毒的選擇和變異。這些新變異集中於NP蛋白的C-末端和非編碼區,及VP35的非編碼區。大部分頻率低於5%的突變在第24代丟失,除了VP40兩個變異(L27S和N42H),從第24代病毒群的5%躍至病毒儲備物的100%。經過細胞傳代,VP35的非編碼區的所有變異都固定了。細胞傳代獲得的突變在病毒儲備物中以更低(9-13%)或很高(89-100%)的頻率出現。對這個病毒儲備物先前用Sanger 測序鑑定的全部變異也被發現,除了位置19104和19105的變異。研究者通過NP-VP35基因間的新突變,認為對細胞培養的適應影響了病毒的基因序列而不是蛋白。
Fig 4.Location and frequency of each mutation at Passage 24 and in the Virus Stock
這是首次對馬爾堡病毒適應新宿主時發生變異的詳盡的觀察,且揭示了病毒適應宿主和人們監視適應的「熱點」(NP的5』非編碼區,VP40前100個胺基酸及VP35),完善了對病毒適應宿主基因組變異的認識,也為伊波拉病毒監測提供了新的思路。
撰文:烏龜,本期編輯:Bioclock
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