液體活檢 CTC-iChip系統:肝癌實時監控的靈敏手段

原創：肝膽醫生蔣貝格

微信公眾號：肝膽柳葉刀/AlleyClinic

作為全球致死率第二高的癌症——肝癌，每年大概有76.5萬人因肝癌死亡。臨床實踐證明，肝癌成功切除後的預後，取決於早診斷。只要在極早期/早期被診斷出來肝癌，並加以有針對性的治療，肝癌的治癒率將會大大地提高。目前的肝癌篩查的方法有：血液AFP的檢測、腹部超聲、CT、MRI等檢查。雖然，上述方法能夠發現部分小的肝臟腫瘤，但是敏感性、特異性都較低，而且肝癌的良、惡性病變相對較難判斷。

一、微流控CTC-iChip系統

肝癌在癌變早期會有少量的肝癌細胞會隨著血液循環進入血管中，但是由於細胞量很少，或者由於血液中有大量的紅細胞、白細胞等及其他臟器來源的細胞的幹擾往往不能夠靈敏地、特異地檢測到肝癌細胞。最近，來自美國哈佛醫學院的Haber教授帶領的研究團隊發明了一種技術，能夠通過檢測血液中極微量的肝癌細胞來篩查肝癌的發生。該技術命名為微流控CTC-iChip系統（microfluidic CTC-iChip）。

微流控CTC-iChip系統的工作原理：將抽提的血液放入CTC-iChip微流控裝置中，在CTC-iChip微流控裝置中首先根據細胞大小將血液中的紅細胞、血小板和血漿分離出去，然後利用結合有白細胞CD45、CD16和CD66B抗體的磁珠將白細胞分離出去，經過CTC-iChip微流控裝置後血液循環中的癌細胞（circulating tumor cells，CTCs）被富集；然後再通過檢測肝癌細胞特異的轉錄子來判斷這些癌細胞是否來自肝臟（圖1）。

圖1. 微流控CTC-iChip系統篩查血液中的肝癌的工作原理。CTC: circulating tumor cell,血液循環中的腫瘤細胞；WBC：white blood cell，白細胞。

二、微流控CTC-iChip系統的優勢

特異性和靈敏性是肝癌篩選最關係的兩大問題，那麼，微流控CTC-iChip系統是如何做到特異性和靈敏性的呢？

1、特異性

10個肝癌特異標記分子確保特異性：每個細胞都有自己特異的分子來行使自己的功能，毫無疑問肝癌也存在自己特異的分子-即肝癌特異分子標記物。對現已公開的微陣列資料庫中的2萬個基因進行分析，挑選出在血液細胞、肝臟以外的臟器都不表達但是在大部分肝癌中高表達的100個基因。然後，利用CTC-iChip系統檢測分別檢測10個患有肝癌的病人和8個健康的志願者的血液中上述得到的100個基因。通過比較分析，最終確定10個基因作為特異性檢測循環中的肝癌細胞（圖2）。

（註：10個基因為甲胎蛋白（Alpha fetoprotein，AFP），a2-羥色胺糖蛋白（alpha 2-HS glycoprotein，AHSG），白蛋白（albumin，ALB），載脂蛋白H（apolipoprotein H，APOH），脂肪酸結合蛋白1（fatty acid binding protein 1，FABP1），纖維蛋白原b鏈（fibrinogen beta chain，FGB），纖維蛋白g鏈（fibrinogen gamma chain，FGG），磷脂醯肌醇蛋白聚糖3（glypican 3，GPC3），視黃醇結合蛋白4（retinol binding protein 4，RBP4），和轉鐵蛋白（transferrin，TF）。

圖2. 微流控CTC-iChip系統能夠特異地識別肝癌細胞。

2、靈敏性

完整全轉錄組擴增和微滴式數字PCR系統提高檢測的靈敏性和特異性：將分選得到的CTC細胞作完整全轉錄組擴增（whole-transcriptome amplification，WTA），經完整全轉錄組擴增的cDNA分子被包裹在單個液滴中再通過液滴PCR擴增進行定量分析判斷。為了證明上述技術的靈敏性，將1、3、5、10或50個HepG2細胞混入4毫升健康供體的血液，然後通過CTC-iChip系統檢測。發現該技術能夠檢測到一個肝癌細胞，當然肝臟特異基因信號會隨著細胞數量的增加而增加（圖3）。

圖3. 餅圖顯示經過完整全轉錄組擴增後可以提高檢測的靈敏性。

可見，該肝癌篩選系統有如下幾大優勢：

1、無創檢測，檢測時只需要提取血液即可

2、特異性高

3、靈敏高，在肝癌的極早期就能夠檢測到

與傳統的肝癌篩查指標（AFP）的比較：

1、通過檢測兩名肝癌患者（編號分別為HCC-041和HCC-075），間隔1周抽取他們血液分別作CTC-iChip和血液AFP檢測，發現CTC評分（CTC-iChip檢測獲得的指標）在兩個患者都很高，而血液AFP在HCC-075患者體內沒有檢測到，說明CTC-iChip系統的特異性更高（圖4A）。

2、兩個肝癌患者（編號分別為HCC-058和HCC-060）接受外科腫瘤切除術，利用CTC-iChip和血液AFP檢測進行術後，結果顯示CTC評分更加靈敏（圖4B）。

3、在接受免疫檢查點抑制劑（NIVolumab）治療後，HCC-042患者的CTC評分顯著下降，術後3wk進一步縮小（圖4C）。值得一提的是，在這五位患者中有三位（HCC-042、HCC-058和HCC-075）血液中的AFP由於低於臨床檢測的最低值（

圖 4. CTC評分較血液AFP檢測系統能夠更靈敏、更特異地檢測肝癌及監控肝癌的治療情況。

三、微流控CTC-iChip系統的應用

介於CTC-iChip系統的無創傷、高靈敏性、高特異的優點，可以應用到：

1、大規模的篩查肝癌

2、實時監控肝癌的治療效果

3、評價肝癌的復發，痊癒情況

小結

全世界半數左右的肝癌病人集中在中國，佔我國惡性腫瘤死亡率的第二位。肝癌早期診斷難，大多數HCC 患者確診時一般已是中晚期；復發後轉移率高。假如能夠做到「早發現、早治療」肝癌的死亡率可能會大大降低。微流控CTC-iChip系統已經廣泛應用於其他癌症的篩查。隨著技術的進一步完善，希望該技術能夠用於肝癌的篩查、實時監控肝癌的治療及治療療效的評價將極大提高肝癌的防治水平。

參考文獻

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