寫在前面：
本次更新主要介紹雜交捕獲中出現非特異性雜交的問題，以及如何儘量有效避免非特異性雜交。
1.非特異性雜交是怎麼出現的？
雜交捕獲，顧名思義就是把我們需要的目的片段通過與探針特異性結合的狀態捕獲出來。然而在這個過程中往往會出現一些非特異性的雜交。
說起非特異性雜交，可能每個做雜交捕獲的人大都碰到過這個問題，而且實驗中出現非特異性雜交，可能直接使得洗脫後雜交文庫濃度偏高，進一步導致上機測序中靶率差，最終造成測序失敗。到底在雜交捕獲的過程中非特異性雜交是怎麼出現的？這還得從雜交的源頭說起。
上一期小編介紹了雜交體系中相關試劑和其作用，先看看試劑的影響：
①當Human Cot DNA（作用：封閉大量重複的DNA序列，避免非特異性雜交）漏加/加入不足時,可能會造成基因組片段中大量的重複序列未得到較好的封閉，從而它們之間發生互補配對，探針在捕獲目的片段時「順手」牽扯到非特異性片段：
註：圖中A為Human Cot DNA（黃色表示）封閉較好，未出現非特異性雜交；B表示由於目的片段中重複序列未得到較好的封閉，故在捕獲到目的片段（上面）的同時也「捕獲」到非特異性片段（下面）。
②當Universal Blockers（作用：封閉接頭序列，避免非特異性雜交）漏加/加入不足時,可能會造成文庫接頭未得到較好的封閉，從而它們之間也可能發生鹼基互補配對，探針在捕獲目的片段時同樣「抓」到非特異性片段；
註：圖中A為Universal Blockers（綠色表示）封閉較好，未出現非特異性雜交；B表示由於文庫片段中接頭序列未得到較好的封閉，故在捕獲到目的片段（中間）的同時也可能「捕獲」到非特異性片段（左邊&右邊各一條）。
除了試劑的影響之外，熟練的實驗操作也是避免非特異性雜交有效手段：
當雜交完成後需要進行目的片段的捕獲以及後續的洗脫步驟。捕獲是通過生物親和素標記的探針與鏈黴親和素標記的磁珠特異性結合，再利用固相磁力架吸附磁珠，從而得到目的片段。洗脫分為熱洗脫和常溫洗脫，在洗脫的過程中，目的片段與探針特異性結合不容易被洗掉，然而一些結合不緊密的非特異性雜交片段則被洗脫試劑清洗掉。所以熟練快速的捕獲洗脫操作，既能避免引入雜質汙染，也能減少非特異性雜交，也是下遊高質量測序的保證。
2.小編在實踐中也分享一些避免非特異性雜交的經驗：
①確保雜交試劑加樣準確無誤；
②雜交過程中熟練的操作，在捕獲&洗脫過程時，熱洗脫過程儘量的快速，常溫洗脫中間可適當渦旋震蕩；
③維持良好的實驗室環境，避免氣溶膠等汙染。
待續
小編後續會介紹文庫構建過程中樣本處理時片段化的方法選擇和相關優缺點。
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