睡眠一直以來是人們比較感興趣的研究課題，因為人的一生大約有1/3的時間是在睡眠中度過的。睡眠是每個人生命中的必需品，但它也困擾了很多人的日常生活。
近幾十年，隨著腦電記錄技術的發展，人們發現睡眠過程並不是一成不變的。從腦電的檢查結果來看，正常人在睡眠時，存在兩種截然不同的現象：有時眼球快速來回活動，被稱作快速眼動期睡眠（REM），有時眼球不活動或者只有很慢的浮動，被稱作非快速眼動期睡眠（NREM），同時腦電活動也出現了不同的變化。
雖然，我們對睡眠的不同階段有了一些了解，但是對睡眠的腦機制尚不清楚。當前研究發現表明，如果腦中的下丘腦視前區（Preoptic area， POA）發生了損傷，會導致嚴重的睡眠障礙，這說明視前區在睡眠的產生中起到重要的作用。然而，到底是哪些神經環路促進了睡眠很不清楚，尤其是睡眠神經元和清醒相關神經元在空間上並沒有明顯區分，這給人們研究特定的睡眠神經環路製造了難度。
這種情況下，鑑定和發現特定的睡眠相關神經元顯得尤為重要。最近，Nature發表了UC Berkeley的丹揚教授最新發現。他們基於投射通路分離了一類POA睡眠神經元，並鑑定了這類細胞的特定分子標記[1]。
研究思路和結果
1.利用c-Fos檢測找到睡眠相關的神經元
要詳細分析睡眠的神經環路，我們首先得找到與睡眠相關的神經環路。文中，作者首先在動物睡眠和清醒狀態下，檢測POA神經元c-Fos表達量（表徵神經元的活動）。通過c-Fos與逆標染料的結果，作者發現POA投射到TMN（組胺能結節乳頭核）的神經環路與睡眠相關（圖1a）；而且， GABA能的中間神經元在此過程中更重要（圖1b）。因此，後面的實驗圍繞這條GABA能神經元介導的POA-TMN神經通路（GABAPOA→TMN）展開。
圖1 GABAPOA→TMN神經元參與睡眠
2.光
遺傳技術操控特定神經環路，研究睡眠行為的變化
作者接下來在GAD2-Cre小鼠（GABA能神經元特異表達Cre）TMN腦區注射能夠逆向標記的病毒rEIAV，在GABAPOA→TMN神經元表達ChR2（照光興奮）或iC++通道（照光抑制）。隨後，作者通過電生理記錄檢測動物的睡眠狀態（即REM\NREM\Wake狀態），並利用雷射激活或抑制GABAPOA→TMN，發現睡眠行為分別發生了增強或減弱（圖2）。
圖2 光
遺傳技術操控GABAPOA→TMN神經元改變睡眠
既然GABAPOA→TMN神經元能夠控制睡眠行為，那麼直接激活POA中神經元是否就能催眠？於是，作者在GAD2-Cre或VGLUT2-Cre小鼠POA注射AAV-DIO-ChR2，在GABA神經元或穀氨酸能神經元表達ChR2，同時使用雷射激活這些細胞和電生理記錄。結果與預想的相反，激活這些神經元反而促進了動物的覺醒狀態（圖3）。
圖3 激活POA腦區GABA能神經元或穀氨酸能神經元促進覺醒
4.光電極記錄鑑定睡眠相關的GABAPOA→TMN
上述「矛盾」是怎麼回事？作者接下來通過光電極記錄手段（光纖+多通道記錄），鑑定了一些能夠被雷射激活的POA區GABA能中間神經元（GABAPOA→TMN），結果發現這些神經元在睡眠中大量活動（圖4），這進一步說明GABAPOA→TMN與睡眠密切相關。
圖4 POA-TMN的GABA能神經元在睡眠時活動
5.通過RNA測序發現睡眠神經元的標誌物
然而，僅僅知道睡眠時活動的神經元是遠遠不夠的，我們還想知道哪些神經元具有促進睡眠的功能？
因而，作者最後使用單細胞RNA測序和翻譯核糖體親和純化（translating ribosome affinity purification，TRAP）技術鑑定了GABAPOA→TMN 神經元的標記物。通過大量篩選，他們發現腸促胰酶肽（CCK）、促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）以及速激肽1（TAC-1）能夠特徵性標記促進睡眠的神經元（圖5）。
圖5 POA睡眠神經元的新分子標記
總結
丹揚教授的研究使用病毒逆向追蹤的手段鑑定了睡眠相關的GABAPOA→TMN通路，同時結合RNA測序技術找到了促進睡眠的視前區神經元標記物。這項工作除了為我們提供了研究功能相關神經元的範例，還為未來的研究提供了標記促睡眠神經元的工具。
參考文獻
1.Chung S， Weber F， Zhong P， Tan CL， Nguyen TN， Beier KT， et al. Identification of preoptic sleep neurons using retrograde labelling and gene profiling. Nature. 2017.