基因編輯器CRISPR的產生和發展

2020-12-06 生物谷

最先提出使用工具的人Michael Wiles

2013年年初，Michael Wiles同美國緬因州傑克遜實驗室的高層管理者坐在一起，並且告訴了他們一種擁有驚人威力的DNA剪切新方法。這家簡稱為JAX的實驗室利用基因工程技術改造以JAXR Mice為註冊商標的小鼠，並將其出售給研究人員。它喜歡這樣自誇：這「是全世界質量最好和發表次數最多的小鼠模型」。Wiles為該實驗室評估和研發新技術。他相信，這個由細菌和古生菌用於保護自身免受病毒侵襲的免疫策略巧妙改編而來的新工具將使JAX改造小鼠的方式發生革命性變化。「在場的十幾個人中，有9個人睡著了。」Wiles表示，「當時沒人聽說過CRISPR。」

Rudolf Jaenisch 在1974 年培育出首個轉基因小鼠，並且首次證明了CRISPR 在產生基因敲除小鼠方面的威力

如今，絕大多數小鼠培育者都知道CRISPR。長久以來，JAX和其他培育新的小鼠品系的實驗室依賴於一個辛苦費力的多步驟過程，其中涉及利用基因工程技術改變小鼠的胚胎幹細胞，將其注射進胚胎，並且培育若干代小鼠。即便是JAX最好的團隊，也需要用2年時間才能成功改造一隻小鼠。CRISPR利用一種可在受精卵上開展針對性基因手術的分子複合物替代了所有這一切。它能在6個月內產生一種被改造的小鼠。

通過基因改造使基因被敲除或遺傳信息被添加進來的小鼠，成為從癌症、動脈粥樣硬化到阿爾茨海默氏症、骨關節炎、肌肉萎縮症和帕金森氏症等一系列人類疾病的關鍵研究模型。基因敲除和敲入小鼠還為研究特定基因的功能提供了一種強大的工具。

「當你在以前培育基因敲除小鼠時，需要具備一些技能。」來自麻省理工學院的Rudolf Jaenisch表示，「現在，你不再需要這些技能。任何傻瓜都能做。」

在科學界影響巨大

CRISPR代表的是「成簇的、規律間隔的短回文重複序列」。它源自原核生物遺傳物質，並且是對後者的一種描述。CRISPR利用嚮導RNA將生物「剪刀」（通常是和CRISPR相關的蛋白——Cas9）傳送到基因組中的某個精確位置。一旦Cas9通過酶解進行了剪切，細胞便會嘗試癒合受傷的DNA。一種修復機制會導致基因敲除，而另一種會導致基因敲入。「CRISPR所做的全部事情是剪切DNA。」Wiles介紹說，「其他一些事情都是細胞修復系統完成的。這就是我們能搭便車的地方。」

細胞的標準反應是試圖將斷點處的雙鏈DNA重新拼接起來。這通常需要吞噬掉或添加一些鹼基，從而導致基因插入或刪除。實際上，這種修復努力會將一些小「排印錯誤」引入DNA文本，從而使基因喪失功能。

Jaenisch首次證明了CRISPR在產生基因敲除小鼠方面的威力。在研究人員首次證實CRISPR在哺乳動物細胞中奏效的5個月後，Jaenisch和同事於2013年5月在《細胞》雜誌上發表了一篇論文。他們報告稱，該技術成功斷開了一組小鼠胚胎幹細胞中的5個基因，而這在以前是不可能的。更重要的是，他們證實可完全繞過胚胎幹細胞，並且同時敲除單細胞小鼠受精卵中的兩個基因。研究人員不再需要改造胚胎幹細胞並不辭辛苦地培育若干代小鼠，以產生卵子或精子細胞中攜帶基因突變的小鼠。同時，研究人員若想培育擁有兩個突變的小鼠，也不再需要將單突變體雜交並經歷一個類似的耗時且煩瑣的流程，以獲得擁有被改變生殖細胞系的小鼠後代。

自此以後，已有500餘篇論文詳細描述了CRISPR如何敲除以及敲入小鼠基因。「它產生的影響是巨大的。」在1974年培育出首個轉基因小鼠的Jaenisch表示。加拿大多倫多大學生物化學家Tak Mak則認為，此項技術真正改變了獲得這些被改造動物的時間和效率。據Mak估測，和利用胚胎幹細胞相比，利用CRISPR改造小鼠的花費要便宜30%左右，從而使他的平均成本大大降低。

革命性意義

CRISPR的影響不能僅通過節省成本來衡量。此項技術的便利和速度使得在匆忙之中改造小鼠成為可能，從而解決了來自多倫多病童醫院的C. C. Hui最近面臨的特定問題：在基因敲除過程中，缺失基因未產生任何可觀察到的效應。Hui意識到，被敲除的基因同另一個可能對其作出補償的基因存在關聯。他向在多倫多表型基因組學中心監管小鼠培育的Lauryl Nutter求援。Nutter利用CRISPR使來自初始基因敲除過程的受精卵中的幹擾基因發生突變。「我們獲得了受精卵，將CRISPR-Cas9注射進去。8周後，Hui便獲得了雙突變體。」Nutter介紹說，「如果利用胚胎幹細胞，可能需要好幾年才能完成。」

這場革命不只限於培育擁有生殖細胞系突變的小鼠。CRISPR還允許研究人員同時使若干疑似癌症基因在成年小鼠體細胞中發生突變。與此同時，CRISPR敲入可修正成年小鼠體內引發疾病的基因缺陷，比如導致血友病和鐮狀細胞性貧血的突變。若干研究小組計劃將CRISPR注射進正在發育的小鼠體內，目標則是創建可發揮條形碼作用的突變並且使科學家得以追蹤細胞分化時的細胞譜系。

諸如多倫多表型基因組學中心、JAX等小鼠培育公司希望，CRISPR將極大地擴展它們產生的突變範圍。「現在，我可以獲得擁有3處基因改造的異乎尋常的小鼠，並能再次改造它。」Wiles介紹說，「我們無法利用胚胎幹細胞進行連續的基因改造。我們可以將一隻擁有兩處基因改造的小鼠同另一隻擁有兩處基因改造的小鼠雜交，但獲得全部4處基因改造需要數年時間。」

任重而道遠

不過，從某個方面來說，CRISPR革命步履蹣跚。在Jaenisch實驗室首次報告CRISPR的3個月後，他和同事在發表於《細胞》雜誌的第二篇論文中提出，CRISPR可輕易實施更加複雜的基因手術，即敲入DNA片段而非簡單地令基因喪失功能。作為示範，他們利用CRISPR將螢光標記敲入小鼠受精卵。當特定基因被開啟時，螢光標記便會亮起。研究人員還創建了對很多研究來說至關重要的條件突變體。

約1/3的小鼠基因對於胚胎發育是必不可少的。如果這些基因從一開始就喪失功能，小鼠便不會誕生。因此，利用胚胎幹細胞開展研究的科學家巧妙地設計出一種被稱為Cre-Lox 重組的系統。該系統僅在小鼠發育到足以在失去上述基因仍能存活下來後才會將基因敲除。這需要添加額外的DNA：位於靶基因兩側的Lox序列和一個Cre基因。其中，Cre基因可被啟動，以產生一種酶，用於修改Lox位點之間的DNA。Jaenisch團隊利用CRISPR將同一系統插入受精卵，並且報告稱以相對較高的效率培育出條件小鼠——約16%的受精卵產生了擁有正確突變的小鼠幼崽。

雖然在英國惠康基金會桑格研究所領導一個團隊培育突變小鼠胚胎幹細胞的William Skarnes是為Jaenisch的最初報告所折服的眾多研究人員之一，但當他試圖將該技術帶入自己的實驗室時卻感到了失望。「從他的論文看，這項技術很簡單。我非常有信心，它將淘汰掉胚胎幹細胞。」Skarnes表示，「但令人失望的是，我們沒有人能重現Jaenisch所報告的效率。在JAX實驗室，產生擁有正確突變的小鼠幼崽的受精卵僅佔1%或2%。同時，很多項目正走向失敗。很明顯，它並未被證實為一種穩健的方法。」

無論目前CRISPR看上去有何種缺點，Wiles強調說，它在改造小鼠方面的潛力不應當被忽視。「CRISPR能做的事情有很多，而我們才剛剛開始入門。」(生物谷Bioon.com)

相關焦點

  • CRISPR鹼基編輯器!讓失明小鼠重建光日的新療法
    這個研究再一次拓寬了我們對CRISPR技術的認知，並為各種因基因突變引起的遺傳性眼科疾病提供了新的治療思路和方法手段。修復效果 | 圖源：Nature Biomedical Engineering遺傳性視網膜疾病(IRDs)是一組由250多個不同基因的突變引起的致盲症狀。以前，沒有任何方法可以治療這些毀滅性的致盲疾病。
  • 盤點|CRISPR基因編輯技術研究進展
    但在非常罕見的情況下，受感染的個體會產生廣泛的中和抗體(bNAbs)，用來對抗病毒。最近發表在《實驗醫學雜誌》上的一項研究中，努森茨威格和他的同事使用CRISPR-Cas9基因編輯技術對B細胞進行了修飾。B細胞是一種分泌抗體的白細胞。研究人員通過改造小鼠B細胞來製造人類自身的bNAbs。
  • 基因編輯大牛揭示鹼基編輯器的作用機制
    2020年7月31日訊/生物谷BIOON/---在短短八年內，CRISPR-Cas9已經成為基礎研究和基因治療的首選基因組編輯器。但CRISPR-Cas9也催生了其他潛在的強大DNA操縱工具，從而可能幫助修復導致遺傳性疾病的基因突變。
  • 特別匯總：基因編輯技術的發展歷程
    第一個胞嘧啶鹼基編輯器和第一個腺嘌呤鹼基編輯器分別由David Liu實驗室的Alexis Komor（現UCSD副教授）和Nicole Gaudelli（現Beam Therapeutics公司的科學家）發明（詳見 BioArt 報導：Nature 發表基因編輯最新成果 ， 無需切割 DNA 也能自由替換 ATGC）。
  • Nature Biotechnology:新的CRISPR C-G DNA鹼基編輯器
    新的鹼基編輯器也被設計成最低化可能導致不良副作用的意外（「偏離目標」）突變。新的CRISPR引導的DNA鹼基編輯技術旨在有效地誘導DNA鹼基的「易位」改變，同時最小化不需要的「看熱鬧的」突變水平。這篇發表在《Nature Biotechnology》的文章描述了這款名為CGBE1和一個更小的版本miniCGBE1的概念驗證，Ibrahim C.
  • 提升基因編輯效率尋找新CRISPR酶 新銳公司完成$6500萬A輪融資
    近日，總部位於加州的Metagenomi公司宣布完成了6500萬美元的A輪融資，本輪融資由Leaps by Bayer和Humboldt Fund共同領投，其他參投機構還包括Sozo Ventures、 Agent Capital、 InCube Ventures和HOF Capital。
  • 基因編輯器CRISPR斬獲2020諾貝爾化學獎
    基因編輯技術的飛躍式發展，推動了基因治療的進步。其中，CRISPR/Cas9系統以驚人的速度改變生物的遺傳信息，包括人類。它的準確性和高效性深刻改變了生物研究並推動其深遠的發展。有人將CRISPR/Cas9系統稱為是基因編輯技術中的焦點，基因編輯技術的「佼佼者」。
  • 《科學》：CRISPR兩大先驅合作，揭示單鹼基編輯易脫靶的原因
    以經典的CRISPR-Cas9為基礎，科學家們還開發出一系列工具，例如可以轉換單個核苷酸的鹼基編輯器，以期治療單基因點突變導致的遺傳疾病。然而，這些先進的新技術並非完美，其可能的脫靶效應及潛在的安全隱患同樣十分引人關注。
  • Nature 重磅,線粒體基因編輯工具橫空出世! 劉如謙繼續革新鹼基編輯器
    此前，針對 mtDNA 基因編輯技術 MitoTALEN 和 mtZFN 通過產生 DNA 雙鏈斷裂降解突變線粒體 DNA，致線粒體 DNA 拷貝數下降。故新的鹼基編輯器對人類線粒體疾病的研究和治療意義重大。
  • Nat Biotech 導讀 | 雙鹼基編輯器、編輯器定向優化等
    在設計更加複雜的蛋白質機器以高效和專一的方式催化所需要的改變以及將大分子轉移到組織和細胞的方法方面，科學家們在不斷取得進展。許多進展雖尚未進入臨床發展，但最終將有助於臨床治療並在基因編輯方面發揮其全部潛力。
  • 「雙劍合璧」——李大力組開發新型雙鹼基基因編輯器
    這兩種鹼基編輯器能在不產生DNA雙鏈斷裂的情況下，在4-8(距離PAM遠端起)窗口內分別實現精準的CG到TA或AT到GC 的替換,高效、精準和低脫靶的特性使其逐漸成為基因編輯領域的新寵【2,3】。在疾病模型製作、精準基因治療、動植物遺傳育種，耐藥性篩選等領域展現出光明的發展前景【4,5】。
  • 《科學》:CRISPR兩大先驅合作,揭示單鹼基編輯易脫靶的原因
    以經典的CRISPR-Cas9為基礎，科學家們還開發出一系列工具，例如可以轉換單個核苷酸的鹼基編輯器，以期治療單基因點突變導致的遺傳疾病。然而，這些先進的新技術並非完美，其可能的脫靶效應及潛在的安全隱患同樣十分引人關注。
  • 從同源重組到鹼基編輯器 看基因編輯72變
    前世 基因序列定點敲除或敲入自1953年美國生物學家詹姆斯·沃森和英國生物學家克裡克發現DNA雙螺旋結構以來，人們一直都在積極探索高效便捷的基因編輯技術。到目前為止，基因編輯技術的發展已經到了第三代。「基因編輯技術是一種可以對基因組或轉錄產物進行精確修飾的技術，可完成基因定點突變、片段的敲除或敲入等。」
  • 華東師範大學李大力團隊研發超高活性基因編輯器
    華東師範大學李大力課題組經過兩年多的艱苦攻關，研發出系列超高活性胞嘧啶鹼基編輯器（hyCBE），這一系列新的基因編輯技術針對鹼基突變引起的遺傳疾病，展示出基因治療的巨大潛力。該研究於5月11日在國際著名學術期刊Nature Cell Biology發表。　　「這一組鹼基編輯系列新工具，在實現更高編輯效率和更寬編輯窗口的同時，仍然保持了其精準的工作性能。」
  • CRISPR鹼基編輯器「新星」ABE8e究竟如何比早期ABEs快1100倍的?
    近日，CRISPR 基因編輯奠基人 Jennifer Doudna 在 Science 雜誌發表了題為 DNA capture by a CRISPR-Cas9–guided adenine base editor 的論文，首次解析了單鹼基編輯器 ABE8e 的超高解析度冷凍電鏡結構，揭示了 ABE8e 如何實現 DNA 上的快速脫氨，為單鹼基編輯技術的改進和安全應用提供了一條新的思路
  • CRISPR鹼基編輯器「新星」ABE8e究竟如何比早期ABEs快1100倍的？
    近日，CRISPR 基因編輯奠基人 Jennifer Doudna 在 Science 雜誌發表了題為 DNA capture by a CRISPR-Cas9–guided adenine base editor 的論文，首次解析了單鹼基編輯器 ABE8e 的超高解析度冷凍電鏡結構，揭示了 ABE8e 如何實現 DNA 上的快速脫氨，為單鹼基編輯技術的改進和安全應用提供了一條新的思路。
  • ...高彩霞課題組發現胞嘧啶鹼基編輯器引發意想不到的全基因組脫靶...
    2019年3月2日訊/生物谷BIOON/---在一項新的研究中，中國科學院的高彩霞（Caixia Gao）課題組通過對作為一種重要的作物物種的水稻進行全基因組測序對胞嘧啶鹼基編輯器（BE3和HF1-BE3）和腺嘌呤鹼基編輯器（ABE）產生的脫靶突變進行全面調查。他們發現胞嘧啶鹼基編輯器（BE3和HF1-BE3）誘導全基因組脫靶突變。
  • 科學家提出基因編輯領域發展新方向
    然而，最近發表在Science雜誌上的兩項研究表明，與傳統的Cas9相比，一種早期構建的胞嘧啶鹼基編輯器BE3可在小鼠胚胎和水稻的基因組中造成比Cas9更多的非特異性突變，且這些非特異突變的產生不依賴於sgRNA的特異性引導（Zuo et al., 2019, Science; Jin et al., 2019, Science）；而相同條件下的腺嘌呤鹼基編輯器卻並沒有產生這些脫靶效應（Zuo et
  • 【精華必看】CRISPR-Cas9基因編輯的原理
    基因編輯是近年來發展起來的可以對基因組完成精確修飾的一種技術，可完成基因定點InDel突變、敲入、多位點同時突變和小片段的刪失等。目前，基因組編輯有三大技術：CRISPR/Cas9、TALEN和ZFN。
  • 基因編輯技術-CRISPR/Cas9
    目前已發現三種不同類型的 CRISPR/Cas系統，分布在40%的已測序細菌和90%的已測序古細菌當中。其中二型CRISPR/Cas設計簡單以及操作容易的特性為最大的優點，可應用在各種不同的模式生物當中。CRISPR/Cas是進行基因編輯的強大工具，可以對基因進行定點的精確編輯。