特別匯總：基因編輯技術的發展歷程

撰文 | Leon

責編 | 雪月

較低的編輯效率一直是CRISPR基因編輯技術的「痛點」。CRISPR介導的基因插入依賴於同源修復機制（homology-directed repair，HDR）。相比於非同源末端連接（non-homologous end joining），HDR發生的頻率更低。在不分裂的細胞，HDR的活性進一步被抑制。科學家們除了想辦法提高HDR的效率，還對CRISPR技術進行了修改，開發出了兩種鹼基編輯工具——胞嘧啶鹼基編輯器 (cytosine base editors，CBEs) 和腺嘌呤鹼基編輯器 (adenine base editors，ABEs)。（科學家們也開發了RNA鹼基編輯器，但在本文我們只著重介紹DNA鹼基編輯器。）

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鹼基編輯器可以編輯哪些鹼基？

胞嘧啶鹼基編輯器可以催化C到T的變化 (互補鏈上為G到A) 。腺嘌呤鹼基編輯器會使A變成G（互補鏈上的T變成C)。然而，這只是12種鹼基變化中的4種。

最近，David Liu實驗室開發的prime editing使科學家們能夠實現所有12種可能的鹼基改變（詳情請見 BioArt 報導：David Liu 再出重磅基因編輯工具，可實現鹼基隨意轉換與增刪 ）。

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鹼基編輯器是如何發揮功能的？

鹼基編輯需要三個元素：

Cas酶與脫氨酶組成的融合蛋白，把Cas酶靶向到特定位點的gRNA和位於編輯窗口中的目標鹼基。

第一個胞嘧啶鹼基編輯器和第一個腺嘌呤鹼基編輯器分別由David Liu實驗室的Alexis Komor（現UCSD副教授）和Nicole Gaudelli（現Beam Therapeutics公司的科學家）發明（詳見 BioArt 報導：Nature 發表基因編輯最新成果 ， 無需切割 DNA 也能自由替換 ATGC）。

從左到右：Alexis Komor，David Liu和Nicole Gaudelli（圖源：Nicole Gaudelli的社交帳號）

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胞嘧啶鹼基編輯器是如何工作的？

通過將胞嘧啶脫氨酶（cytidine deaminase）與失活的dCas9偶聯，Alexis Komor創建了第一個胞嘧啶鹼基編輯器【1】，這個融合蛋白可以在不切斷DNA的情況下將胞嘧啶轉化為尿嘧啶，尿嘧啶隨後通DNA複製或修復轉化為胸腺嘧啶。另外，他們還把尿嘧啶糖基化酶（uracil glycosylase，UNG）的抑制蛋白 (UNG inhibitor，UGI) 與dCas9融合，可防止細胞把尿嘧啶重新轉回胞嘧啶。為了提高鹼基編輯的效率，他們還需要一種方法，迫使細胞使用脫氨基的DNA鏈作為DNA修復的模板。為此，David Liu實驗室不用dCas9，而用了切割單鏈DNA的Cas酶。最後得到的胞嘧啶鹼基編輯器BE3隻切割未被修改的DNA鏈，讓細胞誤認為它是新合成的DNA鏈。就這樣，細胞用含尿嘧啶的那條鏈作為模板來進行DNA修復，保留了鹼基編輯的結果。

胞苷脫氨的反應發生在一條DNA鏈上，在不產生雙鏈斷裂的情況下將C轉化為U

BE3系統將人細胞中的編輯頻率提高到30%以上，而引入插入-缺失突變的頻率僅為1.1%。這相比於Cas9介導的同源修復機制有了顯著的改善，因為同源修復介導的平均編輯頻率僅為0.5%，並且會產生更多的插入-缺失突變。CRISPR鹼基編輯可以經歷多次細胞分裂後得到保留，表明此方法可以產生穩定的鹼基改變。然而，鹼基編輯也存在脫靶效應，這是由Cas9酶的脫靶活性帶來的。

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如何提高胞嘧啶編輯的範圍和效率？

自BE3系統的發明以來，許多實驗室都對鹼基編輯器進行了改進，以擴大靶向的範圍，提高編輯的效率，降低脫靶效應。

2016年，日本Kobe University的Akihiko Kondo實驗室開發了Target-AID鹼基編輯器，把七鰓鰻（sea lamprey）的胞苷脫氨酶與Cas9融合【2】。Target-AID的作用與BE3類似，但不完全相同，它靶向的是位於PAM（protospacer adjacent motif）上遊18個鹼基的位置，編輯窗口的大小為3到5個鹼基。

David Liu實驗室嘗試了其他脫氨酶，如AID、CDA1和APOBEC3G，開發了幾種BE3的變體【3】。CDA1-BE3和AID-BE3偏向於編輯緊跟G後面的C，但APOBEC3G的序列偏好不太可預測。

David Liu實驗室還開發了一些Cas9的變體，產生了5個識別獨特PAM序列的鹼基編輯器，擴大了鹼基編輯靶點的數量【4】。他們觀察到，每個鹼基編輯器的活性最低為50%左右。他們還突變了鹼基編輯器的胞苷脫氨酶部分，創建了新的SpCas9鹼基編輯器，編輯窗口僅為1到2個核苷酸。

為了降低鹼基編輯的脫靶效應，David Liu實驗室的Holly Rees等人開發出了HF-BE3，這是一個使用高保真Cas9變體HF-Cas9的鹼基編輯器【5】。HF-BE3的脫靶效應比BE3降低37倍，目標編輯效率的降低幅度不大。為了進一步提高鹼基編輯的組織特異性，他們純化了HF-BE3蛋白，並通過核糖核蛋白（ribonucleoprotein）的形式將其遞送到斑馬魚胚胎和小鼠的內耳，驗證鹼基編輯的效果。

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第四代鹼基編輯工具

第四代鹼基編輯器BE4降低了BE3編輯過程中C到G或C到A轉換的風險。這些副產物可能是在鹼基切除修復的過程中，由尿嘧啶N-糖基化酶（uracil N-glycosylase，UNG）帶來的。科學家在鹼基編輯器上融合了第2個UNG抑制蛋白 (UNG inhibitor，UGI)，可以提高鹼基編輯產物的純度。不僅如此，他們還延長了APOBEC1-Cas9n和Cas9n-UGI的linker的長度，有助於提高產物的純度。第四代鹼基編輯器BE4與BE3相比，C到G或C到A轉換的產物降低2.3倍，插入-缺失突變減少2.3倍。

為了進一步降低插入-缺失突變的形成，David Liu實驗室的研究者們還把噬菌體蛋白Gam連接到BE4的N端【3】。DNA雙鏈斷裂後，非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）會引入許多突變。Gam可以結合於斷裂的DNA雙鏈末端，觸發細胞死亡，從而把這部分細胞清除。

對於哺乳動物細胞，另一個提高鹼基編輯效率的途徑是，提高編輯器的胞內表達，並促進它們進入細胞核。David Liu實驗室修改了BE4的核定位序列（nuclear localization signals，NLS），並優化了BE4的密碼子，產生的BE4max和AncBE4max的編輯效率提高4.2到6倍【6】。

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腺嘌呤鹼基編輯工具

David Liu實驗室的Nicole Gaudelli發明了第一代腺嘌呤鹼基編輯工具，可以把腺嘌呤轉為肌苷（inosine），最後實現A到G的變化【7】。腺嘌呤鹼基編輯工具的開發並不簡單：由於不存在已知的DNA腺嘌呤脫氨酶，他們用定向進化的方法把RNA腺嘌呤脫氨酶TadA改造為DNA腺嘌呤脫氨酶。

圖源：Chemical & Engineering News

經過7輪分子進化，他們獲得了4個腺嘌呤鹼基編輯器 (adenine base editors，ABEs) 。ABE7.10是活性最高的一個，編輯窗口的位置為4-7位鹼基，平均編輯效率為53%。ABE6.3、7.8和7.9的編輯窗口稍微寬一些（4-9位鹼基），8和9位的編輯效率較低。胞嘧啶鹼基編輯器經常產生混合的編輯產物，但腺嘌呤鹼基編輯器並不會引發A到其他鹼基的轉換，這是因為從DNA中去除肌苷的鹼基切除修復發生頻率較低。

在脫靶效應方面，腺嘌呤鹼基編輯器也優於其他鹼基編輯器。在與Cas9的對比中發現Cas9引入插入-缺失突變的概率為14%，而ABE7.10僅為1.2%。儘管他們沒有在全基因組水平對腺嘌呤鹼基編輯器的編輯特異性進行研究，但其他實驗表明，腺嘌呤鹼基編輯器的確是一種高效且精確的鹼基編輯器。

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如何改進腺嘌呤鹼基編輯工具？

David Liu實驗室在構建BE4max和AncBE4max時，也改進了腺嘌呤鹼基編輯工具的核定位和表達水平，改進後的腺嘌呤鹼基編輯工具被命名為ABEmax。

今年的兩篇論文，報導了從ABE7.10進化而來的新型腺嘌呤鹼基編輯工具，這些腺嘌呤鹼基編輯工具的靶向靈活性和特異性都有了顯著的提高。在第一項研究中，David Liu實驗室用噬菌體輔助進化生成了ABE8e (TadA-8e V106W)，其編輯速度比ABE7.10快590倍，脫靶效應並沒有顯著提高【8】。因為腺嘌呤鹼基編輯工具的編輯反應通常很慢，這意味著Cas9可能會在編輯完成之前從DNA上脫落。

Nicole Gaudelli以ABE7.10為起點，發展出40個新的ABE8變體【9】。與ABE7.10相比，ABE8的編輯效率更高，可靶向的位點更多。ABE8可在T細胞中達到98%到99%的編輯效率，有望在細胞療法中得到廣泛應用。

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什麼是雙鹼基編輯工具？

把兩種鹼基編輯工具結合在一起會怎麼樣？最近的幾項工作成功把腺嘌呤和胞嘧啶編輯蛋白融合在一起。

美國Keith Joung實驗室將miniABEmax-V82G和Target-AID與Cas9融合，創建了一個名為SPACE (synchronous programmable adenine and cytosine editor) 的雙脫氨酶編輯器【10】。另一個實驗室採用了類似的方法。華東師範大學李大力實驗室的A&C-BEmax融合了胞嘧啶和腺嘌呤脫氨酶與Cas9【11】。與ABEmax相比，A&C-BEmax的胞嘧啶鹼基編輯活性得到了提高，降低了RNA脫靶活性。

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關於鹼基編輯的幾項重要工作

原文連結

https://blog.addgene.org/single-base-editing-with-crispr