早期有關基因功能的研究工作，如「一個基因一個酶」的假說，明確了基因的鹼基順序，規定了其蛋白質產物的胺基酸數目與排列順序。破譯遺傳密碼實際上就是要找到基因中DNA的鹼基順序與其編碼的蛋白質胺基酸順序的對應關係：幾個鹼基決定一個胺基酸？哪幾個鹼基決定哪種胺基酸？
要判斷哪個三聯體密碼決定哪種胺基酸，首先需要一種人工合成RNA的方法和一個能夠在體外合成蛋白質的實驗系統，這樣，在試管中加入已知序列的RNA，再通過分析新合成的蛋白質產物的胺基酸排列順序就可以推斷密碼子和胺基酸的對應關係。
1955年，科學家發現一種稱為多聚核苷酸磷酸化酶的生物大分子，它能在試管中催化合成RNA，而不需要DNA模板。
1961年，尼倫伯格（M.W.Nirenberg，1927-2010）和馬太（J.H Matthaei，1929—）利用大腸桿菌的破碎細胞溶液，建立了一種利用人工合成的RNA，在試管裡合成肽鏈的實驗系統，其中含有核糖體等合成蛋白質所需的各種成分。當尼倫伯格把人工合成的全部由尿嘧啶組成的RNA加入蛋白質體外合成系統後，得到的新合成的蛋白質只含苯丙氨酸，結果說明UUU是編碼苯丙氨酸的密碼子。這是第一個被破譯的三聯體密碼。
1966年，又有科學家發明了一種新的RNA合成方法，通過這種方法合成的RNA可以是以2個、3個或4個鹼基為單位的重複序列，如 AGUAGUAGUAGUAGUAGUAGU等，用它們作模板合成的蛋白質的胺基酸序列同樣是有規律重複的。如果用 UGUGUGUGUGUGUGUGUG作模板，得到的新合成的蛋白質是由半胱氨酸和纈氨酸交替連接而成的，則可以肯定UGU是半胱氨酸的密碼子，而GUG是纈氨酸的密碼子。利用這種方法破譯的密碼很多，其中包括終止密碼子UGA、UAG和UAA。
1964年，尼倫伯格等找到了另外一種高效破譯遺傳密碼的方法。他們首先在體外合成全部64種三核苷酸分子（即長度為3個鹼基的RNA，如AGC、UCC、UGA等），同時製備20種胺基酸混合溶液，每種混合溶液中分別含有一種用14C作放射性標記的胺基酸和其他19種胺基酸。然後，向各混合溶液中添加tRNA，使各種胺基酸分別與各自的RNA結合，在溶液中形成各種氨醯RNA，如甘氨酸-tRNA、賴氨酸-tRNA等。實驗時，取某一種三核苷酸分子（如CGU）和核糖體混合，再向其中分別加入上述胺基酸混合溶液。如果CGU是某種胺基酸的密碼子，它便會和帶有這種胺基酸的氨醯tRNA以及核糖體結合形成體積稍大的複合體。當使用硝酸纖維膜過濾反應溶液時，只有含核糖體的複合體可以留在膜上，而其他氨醯tRNA將被衝洗掉。從20種反應體系中找出有放射性的硝酸纖維膜，根據該體系所標記的是哪一種胺基酸，便可知道CGU所對應的胺基酸種類了。利用這種方法破譯的密碼子約有50個。
——新人教必修2教參P218-219