《Science Advances》:單向旋轉分子馬達與吸附蛋白的動態交互作用決定間充質幹細胞的命運

2021-01-16 Y L的卡布奇諾

人造的旋轉分子馬達可以將能量轉換為受控運動，並以分子精度驅動系統失衡。利用分子運動來介導吸附的蛋白質層，可以最終指導人類骨髓來源的間充質幹細胞（human bone marrow-derivedmesenchymal stem cells, hBM-MSCs）的命運。當光碟機動的分子馬達嫁接到吸附蛋白預處理的hBM-MSCs上後，旋轉運動可調控其向成骨細胞分化，而沒有旋轉時細胞則不表現出這樣的分化潛能。近期，來自荷蘭的Patrick van Rijn教授團隊通過實驗證實了分子運動的信號傳導作用是由吸附的細胞指導蛋白層介導的，影響粘著-細胞骨架肌動蛋白的轉導途徑，並調節hBM-MSC的蛋白和基因表達。這個獨特的基於分子的平臺為實現動態交互作用調控細胞提供了思路，並為臨床應用的新型動態生物材料工程提供了機會。

分子馬達介導吸附蛋白調控幹細胞分化示意圖

圖1A展示了的表面結合分子馬達介導吸附蛋白並隨後指導幹細胞命運的實驗設計圖。馬達的光碟機動單向旋轉運動僅限於蛋白質吸附和細胞培養發生的表面。對於動態表面，通過靜電相互作用將四酸官能化的光碟機動旋轉分子馬達嫁接到胺改性的玻璃表面上，四腳架連接使馬達單層在表面上穩定定向，並防止不受控制的布朗運動。在連續照射下吸附蛋白質1小時後，將hBM-MSC接種在處理過的運動表面上，以研究細胞粘附、增殖、分化和維持的乾性（Figure 1）。

Fig. 1. 分子馬達誘導的可吸附蛋白層處理後細胞的分化示意圖.

旋轉分子馬達調控細胞粘附和細胞形態

研究人員將未接受UV照射的分子馬達表面作為靜態表面，接受UV照射的則為動態表面，而接受或未接收照射的胺類表面作為兩個對照組。研究人員發現，細胞在靜止或旋轉的玻璃板表面展現出相似的長條狀的細胞形態，但是細胞粘附的數量和細胞的伸展則大為不同。與靜態表面相比，動態表面可以促進細胞的伸長，但是抑制其粘附、伸展和細胞骨架的形成。定量分析顯示了靜態表面與動態表面相比呈現1.3倍的細胞粘附、2.2倍大的細胞伸展和1.9倍多的F-actin表達，然而動態表面表現出了1.6倍的細胞伸長（Figure 2）。這些差異都與細胞接下來的行為和發展密切相關。

細胞的粘附發生在很多行為之前，因此細胞粘附在馬達表面的情況可能會改變細胞的形態。黏著斑（FA）和絲狀偽足介導的細胞與生物界面的交互可以決定細胞骨架的張力以及細胞形態的變化，從而影響後續細胞表達相關的基因及一系列生物功能。通過免疫螢光染色和共聚焦顯微鏡可以觀察到，在靜態表面可以看到有豐富的FA著色而在動態旋轉表面則很難找到FA，定量分析也顯示旋轉表面每個細胞的FA染色區域比靜態表面少2.6倍。但是有趣的是，旋轉表面的絲狀偽足比靜態表面多4.5倍。此外，旋轉表面上的hBM-MSC顯示出緻密且各向同性的F-actin，而靜態表面上的細胞則顯示出定義明確的肌動蛋白應力纖維，具有延伸且排列的形態（Figure 3）。總的來說，這些結果表明，通過蛋白界面的動態空間組織進行的分子運動可介導信號轉導並指導hBM-MSC的命運。

Fig. 2. 不同培養表面的細胞粘附情況.

Fig. 3. 不同培養表面的細胞粘附蛋白表達.

分子馬達表面生物相容性以及細胞粘附和擴散的時間依賴性

只有在生物相容性不抑制細胞行為的情況下，才可能正確控制幹細胞的命運。因此，研究人員將hBM-MSC培養在動態表面上，並通過活/死染色評估其存活率。在沒有FBS的基礎培養基中培養12小時後，經過和未經過FBS處理的運動表面上的活細胞百分比保持在97%以上，這表明沒有明顯的細胞毒性。此外，為了評估hBM-MSC在動態表面上的生存力，在培養12小時和4天後進行XTT生存力測定。結果表明，與靜態表面的細胞相比，hBM-MSC在旋轉表面上的代謝活性在培養12小時和4天後分別提高了230%和20%。細胞在培養4天後，與培養12小時的細胞相比，細胞在所有樣品上的散布面積更高，發育出更多的平行肌動蛋白應力纖維，並形成更多的FA。這些結果表明細胞粘附和擴散是具有時間依賴性的。細胞培養4天後定量結果顯示，初始FBS處理後的旋轉表面和未經初始FBS處理的靜態表面上的每個細胞的面積顯著小於採用初始FBS處理的靜態表面上的每個細胞的面積。此外，初始FBS吸附時，旋轉表面上每個細胞的F-肌動蛋白表達明顯低於靜態表面上的表達。如圖4G所示，培養4天後，具有初始FBS吸附的旋轉表面上和沒有初始FBS吸附的靜態表面上的hBM-MSCs比具有初始FBS吸附的靜態分子基質上的hBM-MSC的每個細胞的FA面積要低（Figure 4）。這些結果表明，即使長時間培養後，旋轉表面上hBM-MSC的宏觀形態和亞細胞結構仍顯示出顯著差異。

Fig. 4. 分子馬達表面生物相容性.

hBM-MSCs在分子馬達表面調控下的分化潛能

接著，研究人員進一步測試了hBM-MSCs在動態下的分化能力。用成骨誘導培養基培養14天後，細胞在旋轉表面表現出更多陽性染色的成骨相關標誌物OPN。此外，PCR測得的OPN基因表達情況顯示，OPN在成骨誘導培養基中比在生長培養基中表達的更多，但是旋轉表面和靜態表面細胞的基因表達情況沒有顯著的差異。研究人員還通過PCR檢測了hBM-MSCs乾性分化潛能相關基因Nanog和Oct4，結果顯示，靜態表面細胞在7天的時候比動態表面細胞表達更多的Oct4，而到了14天則表達量幾乎一樣（Figure 5）。這些結果表明，hBM-MSCs在動態表面培養時具有成骨分化傾向，而在靜態表面培養時則更能維持其乾性。

Fig. 5. hBM-MSCs在分子馬達表面成骨分化和乾性維持.

分子馬達表面調控hBM-MSCs的作用機制

蛋白質在界面上的吸附是一個動態過程，在此過程中蛋白質可能會吸附、重組和分離。研究人員使用帶損耗的石英微天平（QCM-D）實時監控分子馬達和胺功能改性的矽晶片上吸附的蛋白質質量和損耗性能。對FBS和隨後的纖連蛋白（Fn）的吸附追蹤發現，細胞產生的Fn在錨定依賴性細胞的附著中起主要作用。FBS注射導致所有樣品的頻率降低（ΔF）和耗散率（ΔD）增加，表明蛋白質實現了吸附。如圖6A所示，在有和沒有施加紫外線照射下，ΔF下降並穩定在-133 Hz附近，ΔD增大直到穩定在馬達表面上，從而確認了吸附平衡的形成。然後，用PBS衝洗馬達表面，以除去鬆散結合的蛋白質。靜態表面上的ΔF和ΔD到達穩定信號的速度比旋轉表面上的快，這表明蛋白質在靜態表面上的去吸附快於動態表面上的去吸附。此外，旋轉表面上57 Hz的ΔF的變化高於靜態表面上45 Hz的ΔF的變化，這表明旋轉表面上蛋白質的吸附增強。有趣的是，靜態表面的26 Hz的ΔF的變化要大於旋轉表面上~0 Hz的ΔF的變化，而幾乎沒有Fn吸附在旋轉表面上，這表明靜態表面上的Fn吸附要比旋轉表面更高。對吸附蛋白質質量進行計算也證實馬達的分子運動能夠增加吸附的血清蛋白量，而Fn的吸附趨勢則是相反的。最後，研究人員通過圓二色性（CD）光譜快速分析蛋白質的二級結構和摺疊特性，發現在旋轉表面上BSA的CD強度（208 nm）小於靜態表面上的CD強度，這反映了β-螺旋結構由於展開而損失，而BSA的α-螺旋結構的展開顯著降低了隨後的Fn吸附（Figure 6）。這些實驗結果表明分子馬達的運動調節了初始的血清吸附行為，並因此影響了轉導到幹細胞行為中的Fn吸附。

Fig. 6. 分子馬達調控可吸附蛋白行為.

總結與展望

本文闡述了嫁接在表面上的分子馬達的動態運動可通過介導蛋白粘附層來調控hBM-MSC的命運。在這些在動態變化表面上的幹細胞更易於分化為成骨細胞，而在靜態表面上則更傾向於保持其乾性。並證明了單向旋轉分子馬達增加了血清白蛋白的吸附並在分子規模上相互作用，導致α-螺旋二級結構的減少，繼而影響了Fn的吸附量。獨特的蛋白質吸附行為影響了FA細胞骨架肌動蛋白的轉導途徑，以及肉眼可見的細胞粘附和形態，從而介導了hBM-MSC的命運。本文對細胞培養引入動態影響的理念，為合成分子馬達向生物醫學和臨床應用展現了巨大的前景。

 

 

論文連結：http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/5/eaay2756/DC1

撰稿：吳勰星

審校：劉慧玲

編輯：吳勰星


相關焦點

  • Science Advances: 間充質幹細胞心臟補片,可加強心梗後心臟修復
    正文   最新研究表明，基於間充質幹細胞的   心臟修復補片，可作為一種加強心梗心臟修復的有效手段。  撰文：小明月來源：幹細胞者說常用的提高間充質幹細胞（MSCs）對心梗的治療效果的途徑有兩種：第一條途徑：通過對 MSCs 進行基因修飾，使其改善心梗誘導心臟中的心臟功能和心肌血管生成；第二條途徑
  • 促進人脂肪間充質幹細胞向多巴胺能神經元分化的窖蛋白1
    窖蛋白1是一種質膜內陷形成的多功能蛋白。最近的一項分析表明，窖蛋白1參與調節間充質幹細胞的分化。然而，窖蛋白1在人脂肪間充質幹細胞分化為類多巴胺能神經元細胞的作用仍不清楚。中國大連醫科大學第一附屬醫院的韓朝等一項最新研究，通過RNA幹擾技術下調窖蛋白1以促進人脂肪間充質幹細胞分化為類多巴胺能神經元細胞發現，下調窖蛋白1表達能夠促進幹細胞向類多巴胺能神經元的分化，細胞中酪氨酸羥化酶、Lmx1a及Nurr1的表達均有提高。
  • 5個特性決定間充質幹細胞具有治療疾病的能力!
    那麼間充質幹細胞是如何定向分化成為組織和器官細胞的呢？間充質幹細胞不同的定向分化能力主要取決它所處的周圍環境。 1、間充質幹細胞向軟骨分化 在培養基中加入地塞米松、維生素C、轉化生長因子β，隨後細胞分泌細胞外基質，包括2型膠原、聚集蛋白聚糖等。誘導後用甲苯胺蘭染色著色陽性，表明間充質幹細胞向軟骨細胞定向分化。
  • 對抗皮膚光老化，間充質幹細胞重塑彈性蛋白網絡
    Infusion近年來，科學家發現間充質幹細胞在皮膚光老化治療中潛力巨大手術前3-4個月，研究者在受試者耳前皮膚下注射其自體來源的脂肪間充質幹細胞。結果，研究者發現間充質幹細胞「有足夠的能力，通過組織結構再生修復光老化的皮膚
  • 間充質幹細胞-中科西部細胞,始於2007年
    而人體內環境複雜多變，在不同炎症情況下，間充質幹細胞的免疫調節作用是不同的。科學家研究發現間充質幹細胞的免疫調節具有這樣一種可塑性，即它就像炎症環境的一個調和劑：當炎症反應加強時，間充質幹細胞就會抑制免疫反應；當炎症反應減弱時，間充質幹細胞反而可能促進免疫反應。這種特性在其治療疾病的過程中需要引起高度重視。
  • 間充質幹細胞的「異質性」是指什麼?
    充質幹細胞（MSCs）的異質性，是指貼壁培養的骨髓MSCs是一個混合的細胞群體，存在不同的細胞亞群（比如克隆大小不一樣，見下圖）；有些亞群的細胞具有多潛能特性，有些亞群的細胞具有單潛能特性。不同部位和不同個體來源的MSCs都存在功能和形態上一些差異。
  • 科學網—間充質幹細胞:組織修復的理想「種子」
    在於豔秋看來，間充質幹細胞不但具備幹細胞的增殖分化潛能，還是一種免疫缺陷和免疫調節細胞。同時，間充質幹細胞還可分泌多種具有生物活性的物質，包括一些生長因子和細胞外基質成分，調控細胞外的微環境，因而，它也是組織間質中的重要微環境成分之一。
  • 什麼是間充質幹細胞?全球間充質幹細胞臨床研究現狀概覽!
    相比於胚胎幹細胞，成體幹細胞則有著容易獲取、致瘤風險低以及無倫理爭議等優點，因此成體幹細胞成為了幹細胞臨床應用研究的主要對象。而在眾多的成體幹細胞臨床研究中，間充質幹細胞是最多的一個。間充質幹細胞，是一類起源於中胚層的成體幹細胞，具有自我更新及多向分化潛能。間充質幹細胞不僅存在於骨髓中，也存在於骨骼肌、骨外膜和骨小梁中，且其能夠分化的組織類型十分廣泛。
  • 研究表明,含地塞米松的培養液適合於誘導間充質幹細胞向軟骨分化
    2.4.1間充質幹細胞向中胚層分化間充質幹細胞來源於中胚層，大量研究證實間充質幹細胞可以定向誘導分化為各種中胚層組織細胞。g/L TGF-β的基礎培養液最適合於誘導間充質幹細胞向軟骨分化。胞內信號途徑如絲裂原活化蛋白激酶信號途徑和smads信號途徑被激活後，誘導特異的轉錄因子Sox9、Sox5、Sox6，導致Ⅱ型膠原、蛋白聚糖和軟骨低聚基質蛋白等胞外基質蛋白的分泌，其中Sox9的作用最重要，是間充質幹細胞向軟骨細胞分化的「主開關」。
  • 時玉舫教授:間充質幹細胞和適應性免疫反應
    時教授的報告對間充質幹細胞對適應性免疫反應的影響進行綜述，尤其是它們在優化免疫微環境和修復損傷組織的相互作用。基於近年來時玉舫研究組對於間充質幹細胞免疫學的主要研究成果和該領域的最新進展，系統闡述了間充質幹細胞與免疫系統的相互作用及其機制，疾病發生過程中的作用，並對創傷癒合的影響以及其在臨床應用中的廣闊前景，提出了此領域內亟需解答的關鍵問題。
  • 間充質幹細胞治療的安全性問題
    近年來，間充質幹細胞廣泛應用於多種疾病的治療和研究。間充質幹細胞作為幹細胞療法的「明星成員」，也成為全球研究的熱點。目前，世界上批准上市的幹細胞藥物大多是間充質幹細胞。
  • 我國間充質幹細胞治療銀屑病前景可期
    近期，科技部公示了「幹細胞及轉化研究」重點專項2020年擬立項項目，共計15個項目獲得中央財政經費總計2.4億元的支持，其中包括了與間充質幹細胞治療銀屑病相關的項目-《間充質幹細胞治療銀屑病及銀屑病型關節炎的臨床研究》，牽頭單位為上海交通大學。
  • 間充質幹細胞外泌體治療心血管疾病
    前幾天，我們從科普角度介紹了間充質幹細胞外泌體的生物學特性以及它在疾病治療領域所具有的前景。今天我們來具體看看間充質幹細胞及其外泌體如何在心血管疾病的治療中發揮作用。
  • 臍帶間充質幹細胞臨床案例集錦
    導語 間充質幹細胞是一種多能幹細胞，能分化成多種組織細胞，據有強大的免疫調節作用，是目前應用最廣泛、最安全的幹細胞。 臍帶間充質幹細胞來源於新生兒，相對於成人的間充質幹細胞更加純淨、原始，細胞的增殖、分化及免疫調節能力都更強。
  • 間充質幹細胞的三系分化及鑑定
    近年來國內外關於幹細胞的研究取得了重大的突破，而這其中最熱門的研究當屬間充質幹細胞（mesenchymal stem cell，MSCs）。MSC是一類具有自我更新和多種分化潛能的成體幹細胞，來源於胚胎發育早期的中胚層未成熟的胚胎結締組織。
  • 骨髓間充質幹細胞與舌鱗癌細胞：是促進生長還是靶向生物治療
    在機體調控下，間充質幹細胞具有的歸巢作用能夠使其由原組織位點向新組織位點遷移聚集，從而參與組織、器官的更新及修復，維持機體組織形態和功能。近年來腫瘤靶向生物治療逐漸受到關注，幹細胞技術可以使治療因子選擇性送至腫瘤部位發揮相應作用，骨髓間充質幹細胞在這一方面表現出很大的優勢，但是骨髓間充質幹細胞對舌鱗癌的作用及作用機制尚不明確。目的：綜述骨髓間充質幹細胞對舌鱗癌細胞影響的研究進展，明確其作用並探討作用機制。
  • 探秘臍帶間充質幹細胞
    相比傳統藥物治療，幹細胞在阻斷肺纖維化進程，促進肺部損傷修復等方面顯示出獨特優勢。那麼，什麼是臍帶間充質幹細胞，它又有哪些應用潛力呢，最重要的是，這種幹細胞和我們老百姓又有什麼樣的關係呢？對於這些問題，軍事醫學科學院放射與輻射研究所研究員段海峰博士，分享了他的看法。
  • 人脫細胞羊膜支架促進Scleraxis修飾人羊膜間充質幹細胞體外成韌帶分化
    ：是一種通過對人新鮮羊膜進行物理或化學脫細胞處理後得到的天然支架材料，支架材料內含有較多的膠原蛋白、纖維連接蛋白及細胞外基質等分子，能夠促進細胞在其表面生長並參與調控種子細胞的分化。bHLH結構，Scleraxis基因首先表達於肢芽的間充質幹細胞中，但高水平表達的Scleraxis局限於結締組織發生的區域，如肌腱、韌帶等處。
  • 臍帶間充質幹細胞移植竟無需配型,這是為何?
    現如今，醫學界又提出臍帶間充質幹細胞使用無需配型的說法，這所謂的「配型」，究竟指的是什麼？ HLA 是一大類抗原分子的統稱，雖然種類繁多，但免疫原性強弱不等，因此在幹細胞移植配型時，首先對抗原分子進行基因型匹配。
  • hsa-miRNA-223-3p調控人骨髓間充質幹細胞成骨分化的作用
    目的：探討hsa-miR-223-3p對骨髓間充質幹細胞成骨分化的調節作用。方法：Percoll密度梯度離心法分離、培養骨髓間充質幹細胞，誘導其成骨分化，然後過表達hsa-miR-223-3p，RT-qPCR和Western blot方法檢測Wnt信號通路標誌物Wnt5a及其下遊信號分子OPG、RUNX2的mRNA和蛋白水平變化。