啟動子克隆方法研究進展(2)

　1.3　環狀

PCR

　　環狀PCR包括I-PCR(Inverse-PCR)和P-PCR(Panhandle-PCR)。這2種PCR都是根據一端已知序列設計的嵌套式引物進行PCR。

　　1.3.1　I-PCR I-PCR是1988年由Triglia最早提出的一種基於PCR的改進的染色體步行方法。

     I-PCR的實驗程序包括，基因組DNA經酶切後用T4DNA連接酶進行自連接，產生環狀DNA片段；以環化產物為底物，用根據已知片段設計的反向引物進行PCR擴增，從而得到含有未知片段的擴增產物(流程如圖1所示)。

　　韓志勇等以I-PCR技術為基礎克隆了轉基因水稻的外源基因旁側序列。先用小量法提取轉基因水稻的總DNA，總DNA用10倍過量的限制內切酶進行過夜酶切，酶切片段進行自連接，然後根據工程質粒的T-DNA區設計2對反向引物，進行套式PCR擴增旁側序列。建立了適合於處理大量材料的克隆轉基因水稻中外源基因旁側序列的技術體系。在1周內克隆了35個轉基因水稻株系中外源基因的旁側序列，長度在300～750bp之間。I-PCR法快速、高效、穩定，操作相對簡單，花費少，PCR引物設計比較方便。

　　1.3.2　P-PCR P-PCR是由Jones等提出的利用末端反向重複序列與已知序列互補配對形成環狀單鏈模板，有效增強了引物與模板結合的特異性。反應需要3個根據已知序列設計的引物，3個引物在已知序列內呈線性排列，其中第3個引物可作為接頭使用，可與已知序列互補配對形成鍋柄狀單鏈模板。其過程為，首先酶切基因組DNA，產生5'或3'粘末端，然後連接上合適的接頭(primer 3)，連接好後最好用核酸外切酶I除去多餘的接頭，由於連接上的接頭與已知序列是反向重複序列，變性後的DNA單鏈可退火形成鍋柄狀單鏈模板，之後分別用3個單引物進行3次PCR擴增，能有效地擴增2～9kbp的大片段未知序列(流程如圖2所示)。

　　黃君健等成功地應用P-PCR技術從正常的人外周血單核細胞基因組DNA中擴增端粒催化亞基hTERT基因5'端上遊旁側序列，獲得了hTERT基因翻譯啟始位點上遊2090bp的基因組DNA序列。首先用酶切消化基因組DNA，得到帶有GATC的5'突出端的DNA片段。然後利用已知的hTERTcDNA序列設計PCR引物，用常規的PCR方法擴增出1條大約900bp的基因組特異片段，序列分析為hTERT的基因組DNA片段。根據得到的基因組DNA序列的信息，確定P-PCR的引物退火區，併合成了5'磷酸化的連接寡核苷酸和4條基因特異性引物，其中連接寡核苷酸5'端的4個鹼基CTAG與上述核酸內切酶消化產生的5'突出端GATC互補，然後將連接寡核苷酸與基因組酶切產物連接，以連接產物為反應模板，進行PCR，使模板自身進行退 火-延伸反應，以形成Panhandle結構。最後以單鏈Panhandle為模板，4條基因特異序列為引物進行嵌套式PCR，最終獲得了1條約2kb的含hTERT基因啟動子的DNA片段。Jones等利用改進的P-PCR，在形成panhandle結構之前3'末端連上ddCTP，使引物錯配的機率減少，特異性增加。他們從人類基因組DNA已知位點側翼擴增了4～9kb的大片段未知序列。P-PCR是目前能夠擴增距已知序列最遠的未知DNA序列的方法，有很高的特異性。