4. 濾紙、膠和膜的問題
X. NC膜\ PVDF膜\ 尼龍膜怎樣鑑別？
解答：尼龍膜是較理想的核酸固相支持物，有多種類型；硝酸纖維素膜是目前應用最廣的一種固相支持物，價格最便宜；PVDF膜介於二者之間。
就結合能力而言：尼龍膜結合DNA和RNA能力可達480－600μg/cm2，可結合短至10bp的核酸片段；硝酸纖維素膜結合DNA和RNA能力可達80－100μg/cm2，對於200bp的核酸片段結合能力不強；PVDF膜結合DNA和RNA能力可達125－300μg/cm2。
就溫度適應性而言：尼龍膜經烘烤或紫外線照射後，核酸中的部分嘧啶鹼基可與膜上的正電荷結合；硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結合DNA，結合不牢固；PVDF膜結合牢固，耐高溫，特別適合於蛋白印跡。
就韌性而言：尼龍膜較強；硝酸纖維素膜較脆，易破碎；PVDF膜較強。
就重複性而言：尼龍膜可反覆用於分子雜交，雜交後，探針分子可經鹼變性被洗脫下來；硝酸纖維素膜不能重複使用；PVDF膜可以重複使用。
Y. 在做Western Blot時，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？
解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質結合，做小分子的蛋白轉移時多加甲醇也是這個目的。
Z. 檢測磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一張膜上嗎？
解答：可以。
AA. 轉膜後經麗春紅染色的條帶，為什麼大蛋白分子的一端（即點樣空的一側）的轉膜好象不是很好，為什麼？
解答：這是正常的，大分子的蛋白轉移的慢， 你延長轉移時間和電流，大分子一端就會好的多，但是小分子的就有可能會變淡。
BB. 我想問您裂解細胞用三去汙裂解法，還是用上樣緩衝液？
解答：用上樣緩衝液，這樣有幾個好處，可以提取總蛋白，同時又可以讓磷酸化酶失活。
CC. 採用tank system有什麼講究？
解答：建議低電壓，長時間，（一般tank System 用衡壓好點），如 28V 14－16hrs。
DD. 做HSP WESTEN定量，同樣的抗體免疫組化能做出，而WESTEN卻不能？
解答：這多半是抗體的問題，要看抗體的說明，是否能做Western Blot和IHC。
EE. 膜一般要如何處理？
解答：一般用甲醇泡泡就可以了。
FF. 如果是6×8轉印膜，要加多少一抗？
解答：一抗的稀釋度是有說明的，根據你的一抗看看就知道了，但是那麼大的膜孵育體積一般最少為3－5ml。
GG. 上下槽緩衝液有何要求，怎樣才能達到最佳效果。
解答：無要求。
HH. 跑電泳的時候配的膠總是「縮」是什麼原因呢？是有的成分不對嗎？
解答：沒什麼問題，就是你膠裡的水分被蒸發了。過夜時拿保鮮膜包起來，在裡面加點水保持溼度就可以了。如果過夜，膠裡的水分被蒸發，採用保鮮膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙醯胺）有問題，你可以重新配製一份觀察；能夠替換的試劑，儘量換一下，選用好的試劑，避免找問題麻煩。脫色液中甲醇的含量太高也會造成膠縮。
II. 膜、濾紙、膠大小有何講究？
解答：如果是用的是半乾轉，順序為：陰極－》濾紙－》膠－》膜－》濾紙。濾紙的長寬分別比膠小1－2mm，而膜的長寬分別比膠大1－2mm。絕對禁忌：上下兩層濾紙因為過大而相互接觸，這樣會短路，電流不會通過膠和濾紙。
JJ. 蛋白質的分子量跨度很大，如要分離小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？
解答：這麼廣的分布不好轉移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉，12％SDS-PAge， 溼轉36V ， 3－5hrs就可以了， 可以根據你實驗室的經驗調節；170kd 用7%SDS－page， 48V 10hrs－16hrs。
KK. 不能很好地將大分子量蛋白轉移到膜上， 轉移效率低怎麼樣解決？
解答：可以考慮：轉移緩衝液中加入20%甲醇（是指終濃度）(優化的轉移緩衝液，可以參考《蛋白質技術手冊》)，因為甲醇可降低蛋白質洗脫效率，但可增加蛋白質和NC膜的結合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質可延長轉移時間；轉移緩衝液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉移效率；用優質的轉移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交聯；低濃度膠，如低至6％。太大時還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉移電壓／電流；增加轉移時間。
LL. 如何選擇最合適的蛋白雜交膜？
解答：蛋白質印跡雜交是分子生物學實驗中極為常用的一門技術。選擇質量上層、合乎要求、方便適用的雜交膜是決定這項實驗成敗的重要環節。根據雜交方案、被轉移生物大分子的特性以及分子大小等等因素，我們要量體裁衣，從雜交膜的材質、孔徑和規格上都要做出合理的選擇。
硝酸纖維素膜：硝酸纖維素膜是蛋白印跡實驗的標準固相支持物。在低離子轉移緩衝液的環境下，大多數帶負電荷的蛋白質會與硝酸纖維素膜發生疏水作用而高親和力的結合在一起，雖然這其中的機制還不是十分清楚，但由於硝酸纖維素膜的這個特性，而且易於封閉非特異性結合，從而得到了廣泛的應用。在非離子型的去汙劑作用下，結合的蛋白還可以被洗脫下來。根據被轉移的蛋白分子量大小，要選擇不同孔徑的硝酸纖維素膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結合就越牢固。但是膜孔徑如果小於0.1mm，蛋白的轉移就很難進行了。因此，我們通常用0.45μm和0.2μm兩種規格的硝酸纖維素膜。大於20kD的蛋白就可以用0.45μm的膜，小於20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如果用0.45μm的膜就會發生「Blowthroμgh」的現象。從膜的質地上來看，最重要的指標就是單位面積上能夠結合的蛋白的量。硝酸纖維素膜的結合能力主要與膜的硝酸纖維素的純度有關，市場上有些硝酸纖維素膜通常會還有大量的醋酸纖維素，因而降低了蛋白的結合量。S&S公司採用的是100%純度的硝酸纖維素，保證了最大的蛋白結合量，可達80-150μg/cm2。由於100%的純度，因而也大大減少了非特異性的結合，降低雜交背景，無需高嚴謹度的洗脫步驟。其次，膜的強度和韌性也是需要考慮的因素。常規的硝酸纖維素膜比較脆，漂洗一兩次就會破損，不能反覆使用。
PVDF轉移膜：PVDF是一種高強度、耐腐蝕的物質，通常是用來製造水管的。PVDF膜可以結合蛋白質，而且可以分離小片段的蛋白質，最初是將它用於蛋白質的序列測定，因為硝酸纖維素膜在Edman試劑中會降解，所以就尋找了PDVF作為替代品，雖然PDVF膜結合蛋白的效率沒有硝酸纖維素膜高，但由於它的穩定、耐腐蝕使它成為蛋白測序理想的用品，一直沿用至今。PVDF膜與硝酸纖維素膜一樣，可以進行各種染色和化學發光檢測，也有很廣的適用範圍。這種PVDF膜，靈敏度、解析度和蛋白親和力在精細工藝下比常規的膜都要高，非常適合於低分子量蛋白的檢測。但PVDF膜在使用之前必需用純甲醇進行浸泡飽和1-5秒鐘。
離子交換型轉移膜：硝酸纖維素和PVDF膜是靠疏水作用結合蛋白的，還有一類膜是根據離子交換的方式結合生物大分子的。由DEAE（二乙氨乙基）修飾的纖維素製成的DEAE陰離子交換膜同樣可以 作為蛋白質印跡的固相支持物。DEAE可以有效的結合陰離子基團，包括那些高於其等電點的蛋白質。在pH10以下，DEAE基團都能帶電荷，在低離子強度的轉移液中結合蛋白分子。其最適的pH環境為5-7。DEAE膜可以用於蛋白多糖、病毒、酶以及血紅蛋白的研究。這種0.45μm孔徑的DEAE膜，除了可以做Western Blotting外，還可以用於核酸結合研究。
還有一種離子交換型膜是羧甲基（CM）修飾的纖維素膜，它可以結合蛋白和多肽分子，以及其他的一些帶正電荷的樣品，最適結合pH範圍在4-7。結合的多肽分子可以從CM膜上洗脫下來，用於胺基酸系列分析或微測序。
5. Marker的相關疑問
MM. 我用的是可視marker（BIO_RAD），但是電泳總跑不全8條帶，請問什麼原因？怎樣改善？膠用過8％，10％，12％，都是這樣。marker是新買的。
解答：一般來說，是小分子量Marker跑走了，增加膠濃度或減少電泳時間試試看。當然梯度膠也是不錯的選擇。
NN. 用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd組成的marker。開始做Western Blot時還能夠看到marker，當然也僅能看見其中最多三條帶。用80V進行SDS-PAGE電泳，用恆壓10V45min轉印的。前幾次做Western Blot時沒有進行麗春紅染色，但儘管用了此方法也僅能看到marker有一條大約是30KD的條帶出現。再就是把70KD和130KD兩個目的蛋白同時在一塊膠上進行分析，用培養基樣品進行分析，沒有用間接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶聯抗體（Anti-V5-HRP）。但就是出不來結果，我很茫然。謝謝您過給予指點！
解答：1、「我用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd組成的marker。開始做Western Blot時還能夠看到marker，當然也僅能看見其中最多三條帶。」有的時候，Prestained Marker 放久了效果就會變差，電泳是條帶不清晰，擴散。但是你的問題可能還有其他的方面的問題，可能是蛋白跟膜結合的不緊密。轉移是多加點甲醇。
2、「前幾次做Western Blot時沒有進行麗春紅染色，但儘管用了此椒ㄒ步瞿芸吹絤arker有一條大約是30KD的條帶出現。」轉移時半乾法建議用恆流，你這樣的也就30kd-50kd的轉移地比較好。
3、「再就是把70KD和130KD兩個目的蛋白同時在一塊膠上進行分析，用培養基樣品進行分析，沒有用間接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶聯抗體（Anti-V5-HRP）。」
是否檢測了表達量，二抗是否是好的，你做了陽性對照？你要做這麼大的蛋白最好轉移時間延長到1.5hrs。