檢測多個樣品中的一系列黴菌毒素—用於免疫分析多路微流系統

在食品和原料中，真菌毒素的檢測變得越來越重要，因為這些毒素，例如麴黴毒素A（ochratoxin A，OTA），黃麴黴毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）和 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），都受到歐盟嚴格法規的約束。

位於葡萄牙裡斯本的納米科學與納米技術研究所一個課題組開發了一種帶有手動電磁閥的負壓驅動裝置的微流控系統，實現了在大約0.12mm^2的區域內以層流模式驅動，並隨後通過HRP標記的抗體產生化學發光，從而實現了這三種真菌毒素的同時免疫檢測。

在不到20分鐘的時間內，檢該裝置可以測到三種黴菌毒素的存在，其中OTA和DON的濃度為100 ng/mL，AFB1的濃度為3 ng/mL。通過在微流控晶片下方集成25×25μm^2氫化非晶矽（a-Si：H）光電傳感器的微型陣列，在每個採樣步驟中執行晶片上光學檢測。

黴菌可能產生致命毒素

亮點

內置磁體的PDMS晶片：

該組設計並加工了內置嵌入式N48鍍鎳NdFeB棒狀磁體（直徑3毫米，高度6毫米）的聚二甲基矽氧烷（PDMS）裝置：

首先，將Sylgard184溶液以1:10固化劑與PDMS低聚物的比例混合，離心除氣並旋塗在SU-8模具頂部，通道高度為20微米，平均最終厚度為200微米，後在對流烘箱中於70°C烘烤30分鐘。在烘烤步驟之後，將磁體手動對準PDMS層的頂部，並完全浸入第二層較厚的未固化PDMS中。隨後將該裝置在相同條件下再烘烤75分鐘，然後從模具上剝離下來。最後在打孔後與另一層PDMS密封。

光電導體陣列：

光電導體陣列的微細加工始於通過直流磁控濺射在乾淨的玻璃基板上沉積鋁，然後通過光刻和使用鋁蝕刻劑的溼法化學刻蝕將其圖案化為平行電極。隨後在定製的電容耦合射頻反應器中，通過射頻等離子體增強化學氣相沉積（radio frequency Plasma-Enhanced Chemical Vapor Deposition，rf-PECVD），以100 mTorr的沉積壓力，250°C沉積溫度和13.56 MHz RF的功率，沉積本徵500 nm厚的a-Si：H光電導層。a-Si:H島通過光刻法定義，然後進行化學離子蝕刻。最終的透明SiNx鈍化層通過rf-PECVD沉積，導孔通過在接觸墊上剝離而打開，以實現引線鍵合。最後將光電導體晶片切成小方塊，進行晶片鍵合併將引線鍵合到定製好的印刷電路板上。

9個光電傳感器中的每一個都以500 ms的採樣速率連續尋址4 s，使得每個傳感器通道採集8個數據點。在黑暗條件下開始數據採集，並且注射泵停止。

導體陣列

負壓進樣、多路檢測：

通過在一條通道中流動三股含有BSA毒素綴合物的流體（充當捕獲劑），然後在垂直通道中流動三股包含抗毒素HRP抗體（作為靶標）的流，獲得9個獨立的生物傳感區域的矩陣，可以同時檢測三種不同樣品中的三種不同分析物。

為了使液體分別沿每個方向流動，設備中集成了一個電磁閥系統，該電磁閥系統包括在微通道上方200μm固定距離處的NdFeB永磁體，每個磁體產生的磁場為1.37–1.42T。這些閥通常為打開並可以通過將極性相反的磁體面對嵌入式磁體來關閉。在磁體之間施加的力足以壓縮PDMS並關閉微通道。關閉時，該閥系統可承受的壓力至少為300 kPa，這要受到密封膜分層的限制。取下磁鐵後，閥門將在不到1秒的時間內打開。

為了進一步簡化系統，通過在出口處施加負壓來控制液體的流動，進口的目的是使隔離液在捕獲器和目標物流動之前同時在通道內流動，從而產生3個離散的被隔離流隔開的流路，並防止在流之間的區域中吸附。將PEG作為三種抗體之間的阻隔劑，並且在另一個方向上的三種BSA毒素綴合物流道做相似的阻隔。

PEG阻隔劑：

基於PEG的隔離液有如下的作用：（1）通過施加負壓提供穩定的溶液流；（2）用於主通道潤溼的惰性介質，可防止一個捕獲器/目標溶液的交叉溶液汙染，從而溶液進入通道之前將通道潤溼；（3）由於隔離物溶液和捕獲器/目標溶液之間的折射率差異，改善了在顯微鏡下監控過程的對比度；（4）消除目標溶液之間的最小橫向擴散，直至光學視窗區域。

結果

結果表明，AFB1，DON和OTA的檢測限（limit of detection，LoD）至少為0.1、0.3和1 ng / mL。該結果驗證了競爭分析和基於化學發光的檢測本身的體系結構，然後在多路復用設備中對檢測進行了測試，所獲得的靈敏度符合OTA和AFB1和OTA1食品和飼料中絕大多數的監管規定。結果表明，多重免疫測定法可以同時檢測加標在緩衝溶液中的DON，OTA和AFB1，其中被汙染的溶液的平均相對化學發光信號為62.6±1.6％，64.6±4％和66±2.1％（平均±SD），相對於對應的參考值，DON，OTA和AFB1的未汙染溶液的信號分別為92％，98％和105％。

總結

這個實驗的設計顯然是fancy的，可以做到3種目標溶液的快速檢測，並且具備一定的自動化潛力。在supporting裡面，還可以看到5種目標溶液檢測的擴展情況，同樣具有一定的實用價值。

局限與思考

這個東西的好處在於實現自動化的潛力不錯，壞處在於有點麻煩。3*3的流路設計由於異形檢測區的存在已經導致光電傳感器陣列布置不規則，如果擴展其到5*5甚至更高的設計，數據採集data acquisition將是很討厭的事情。

好處在於CMOS價格越來越低，算力的提高也可以是的圖像處理變得更易用，通信技術的提高也提供了將運算部署在雲端並實時提供結果的潛力。將光電傳感器陣列替換為攝像機可能更符合今天的技術發展趨勢。

不過流路設計上的缺陷是原生的，很難改進。這也導致這個只能在paper上出現了。

引用

Soares, Ruben & Dos Santos, Denis & Chu, Virginia & Azevedo, Ana & Aires-Barros, Maria & Conde, J.P. (2016). A point-of-use microfluidic device with integrated photodetector array for immunoassay multiplexing: Detection of a panel of mycotoxins in multiple samples. Biosensors & Bioelectronics. 87. DOI: 10.1016/j.bios.2016.09.041.