在過去的十年中，細胞療法，生物製造和合成生物學的進步推動了全球幹細胞療法行業的發展。幹細胞治療為一些疑難雜症提供了一種新的選擇。幹細胞治療的目的就是替代或者再生體內功能失調或受傷的細胞、組織或器官。幹細胞可以在向患者給藥之前，在體外改變它們的生物學特性，從而達到更加精準和高效的治療。現今，幹細胞的治療從傳統的輸血到自體幹細胞移植，到最新的同種異體工程細胞治療。
幹細胞分化（圖源：Wikipedia）
然而製造這些「活的藥物」的複雜性不容小視。每種產品在其開發、製造、分裝和上市的每個階段，都面臨著特定的挑戰和其不同的複雜性。在幹細胞治療領域，細胞原材料就顯得尤為重要，細胞的來源、穩定的供應、細胞運輸、製造、產品開發、治療方案和治療過程這些都決定了治療方法的成敗。
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間充質幹細胞的應用
1991年，美國生物學家Caplan首次從骨髓基質的支持性組織中分離出一些成體幹細胞，這些細胞具有分化成軟骨、骨和脂肪組織的能力，並可為造血幹細胞發育成各型血細胞提供所需信號因子，被命名為間充質幹細胞( mesenchymal stem cell，MSCs) 。
富含MSC的人體組織
在此之後，有大量研究報導了MSCs 具有分化多能性，在體外誘導條件天，可分化為外胚層( 如神經細胞) 和內胚層( 如肝細胞) 的多種細胞。目前，雖然各國均開展了大量的臨床研究，但成功轉化為商業化產品的數量很少。雖然我國尚未批准任何MSCs商業化產品上市，但隨著臨床個體化幹細胞治療經驗的不斷積累，國產MSCs的申報數量預期會逐漸增加！
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幹細胞療法的質量法規要求
中國的幹細胞臨床試驗，是從以醫院為主體的醫療技術探索開始的。目前在我國，幹細胞按藥品、技術管理的「類雙軌制」監管。按照醫療技術監管的，稱為幹細胞臨床研究，由衛健委監管，目前缺少轉化應用的路徑；按照藥品監管的稱為幹細胞臨床試驗，由國家藥品監督管理局監管，作為藥品上市銷售。
2017年發布的《藥品註冊管理辦法（修訂稿）》明確指出細胞治療類產品可以按藥品進行註冊上市，緊接著《細胞治療產品研究與評價技術指導原則（試行）》的頒布，更加明晰了細胞治療作為藥品申報的標準。
對按藥品開發的細胞產品，國際上要求其整個生產過程均需符合現行人體組織細胞優良操作規範（good tissue practice，GTP） 和藥品生產質量管理規範（ good manufacturing practice，GMP） 的要求，保證質量和批次間一致性。
對活細胞製品來說，建議採用質量源於設計（quality by design，QbD）理念對整個生產過程進行質量控制：
研究者應對全工藝流程進行研究與驗證，證明工藝的可行性和穩健性;
生產工藝設計應避免細胞發生非預期或異常的變化，並能滿足去除相關雜質的要求;
建立規範的工藝操作步驟、工藝控制參數、內控指標和廢棄標準，對生產全過程進行監控;
在此過程中，細胞質量控制、生產過程控制以及細胞放行檢測應是結合互補的關係;
應根據臨床需求和產品自身的穩定性狀況設計產品的劑型和處方工藝。
2018年6月至今，中國已經有12款幹細胞新藥IND獲得臨床默示許可，其中間充質幹細胞產品有種11種，分別是骨髓、牙髓、胎盤、臍帶、異體 / 自體脂肪來源的間充質幹細胞。目前，中國尚未批獲任何形式的幹細胞藥物上市。
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用於臨床級幹細胞製造的基本工藝
MSCs產品的生產工藝是從供者體內獲得組織細胞，直至成品細胞輸入到患者體內的一系列操作過程，通常還包括細胞的凍存和復甦，研發者對其中的每一步工藝和操作均需開展研究和驗證。
有學者將細胞庫建立前的過程歸為上遊工藝，包括供者細胞採集和早期小規模體外培養; 而從細胞庫復甦、大規模生物培養開始，包括細胞培養擴增、微載體分離( 如採用生物反應器工藝) 、純化、濃縮、配製、細胞清洗、冷凍保存、批籤發的生產過程被歸為下遊工藝。
影響 MSCs 產品的質量因素很多。在體外培養過程中主要包括起始原料組織、細胞分離擴增方法、細胞接種密度、培養基和培養設備、培養添加物或生長因子，細胞數量和存活率、細胞群體倍增數等，應明確關鍵質量屬性並進行控制。專家組建議將細胞體外傳代次數控制在20代以內。
穩定性數據是支持MSCs產品應用範圍的重要依據。按藥品開發的MSCs產品，穩定性研究的參照一般生物製品相關要求，還應根據產品自身特點、臨床用藥需求以及保存、包裝和運輸情況設計合理的研究方案，同時需關注產品運輸和使用過程中的穩定性。穩定性研究應能證明，在擬定的存儲條件下，產品的質量不會受到運輸、使用或其他外界條件的影響。
穩定性考察的項目和檢測指標，應根據產品自身的特點和存儲條件合理設計。如冷凍儲存的樣品或產品一般應模擬使用情形( 如細胞復甦過程) 開展必要的凍融研究。考察項目建議涵蓋生物學效力、細胞純度、細胞特性、活細胞數及比率、功能細胞數以及安全性相關指標。
MSC 生產過程中的關鍵工藝步驟和過程控制要素
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幹細胞生產工藝流程的建立和優化
誘導多能幹細胞( induced pluripotent stem cells，iPSCs) ，在性能上接近胚胎幹細胞，下面，我們從iPSC作為幹細胞生產的建立為例來談談有關幹細胞的製造生產。
然而，為了使iPSC發揮其治療潛力，有必要開發符合cGMP的iPSC製造工藝並應對與iPSC庫的來源、特徵和測試有關的挑戰。我們採取了循序漸進的方法來建立合規、可複製的、符合CGMP的iPSC製造流程。在此iPSC製造過程的開發過程中，我們考慮了許多設計：
iPSC的重新編輯（例如，重編程方法的安全性和效率，供體之間的變異性以及起始材料的選擇）
iPSC挑戰（例如，開發用於iPSC生成和擴展，細胞敏感性和質量以及冷凍保存和復甦細胞培養系統）
安全性和質量控制挑戰（例如，正常核型，殘留質粒清除率，評估iPSC質量的過程控制，最終產品的關鍵屬性以及標準安全性問題，例如無菌性）。
表3：使用從小到大的方法建立了可靠的、可複製的、符合CGMP的iPSC製造工藝。這是一個三階段方法：（1）使用基礎技術建立iPSC生成過程；（2）根據流程的關鍵屬性進行流程優化和開發；（3）將製造過程轉移到CGMP製造工廠。每個階段都考慮了許多過程設計：起始材料的選擇、基因編輯方法的安全性以及第一階段的可行性、基因編輯的效率、用於iPSC生成和擴展的細胞培養系統的敏感性和穩定性、建立過程控制、細胞儲存和復甦以及表徵鑑定（階段2）和細胞收穫、生產文件、驗證等等。
第1階段：驗證性實驗
首先，我們重點研究iPSC的起始材料和iPSC生成方法的安全性。我們使用源自臍血來源的CD34+細胞作為起始材料。需要考慮的因素包括：獲得知情同意下的臍血的質量，臍血在臨床應用中的使用，建立臍血存儲庫，以及從臍血中相高效快速生成iPSC血液來源的CD34+細胞（與其他起始細胞類型相比）。
圖1：人類iPSC生產是在基於小鼠胚胎細胞培養系統中使用基於附加型的編輯方法；圖中顯示了與其相關系統上的iPSC製造過程，其中包括處理時間（天）和質量控制活動，包括過程中間控制和最終表徵。製造過程包括CD34+細胞的啟動步驟、CD34+細胞的重新編輯和轉染，將這些細胞在培養系統上、選擇、傳代、擴增和iPSCs細胞的儲存。
使用pEB-C5和pEB-Tg質粒的組合（使用基於Lonza Nucleofector 2比色皿的轉染系統）生成iPSC之後，選擇了多個iPSC（最少6個到10個），並在組織培養板上連續傳代培養。
在這一階段的工藝設計中，使用游離質粒使用多個供體分離的CD34+細胞，可再現生成高質量的iPSC。通過PCR方法評估，在第8-10級通過iPSC時清除了這些蛋白。
第2階段：工藝的開發
在工藝過程開發階段，我們主要致力於基於培養系統來生成和擴展iPSC，以解決有關培養系統使用的擔憂。我們通過結合增強劑來提高其穩定性並解決細胞培養系統中生長的iPSC的問題，從而努力提高工藝過程的效率。
多能幹細胞依賴於錨定並以具有確定邊緣的完整細胞集落的形式生長。它們易自發分化，而沒有抑制這種現象的必要細胞培養要求。最關鍵的細胞培養要求是可以附著和生長的適當底物，支持其增殖並防止自發分化的豐富培養基，以及在保持高活力和多能性的同時連續繼代培養細胞的傳代方法。
下圖是最終cGMP兼容iPSC製造過程的示意圖。與iPSC生成過程而建立的初始過程相比，該過程花費了大約40天的時間，但其目的是保持設定的工藝過程設計的實現。在第4天（基於對CD34+細胞密度和生長的評估）完成CD34 +細胞的引發和隨後的核轉染，而不是在培養過程中進行核轉染的4-6天完成。
圖4：符合CGMP的人類iPSC製造過程進行了概述，該過程在第2階段結束時進行了優化，並具有處理時間（天）和相關的QC活動。該過程包括CD34+細胞的啟動步驟，CD34+細胞的重新編程和核轉染，將其鋪在細胞培養系統上，使用細胞培養系統進行iPSC的集落選擇、傳代、擴增和保存。質量控制活動包括表徵初始CD34+細胞，中間iPSC（基於質量和質粒清除率）以及基於既定的測試和標準進行最終表徵。
階段3：生產工藝的轉移
在建立可重複的工藝流程的iPSC製造流程後，我們致力於將工藝流程轉移到cGMP設施中。從培訓運行過渡到工程運行，再到CGMP製造運行，我們解決了許多製造挑戰，包括組織獲取、生產文檔、供應鏈、過程驗證、設施準備、員工培訓、樣品提交策略、倉儲和存儲。請注意，儘管在第3階段對這些活動進行了重新評估和完成，但某些活動（例如，與組織獲取和供應鏈有關）已在較早的階段或與第2階段的工藝流程優化活動同時啟動。
在cGMP生產的iPSC的QC分析中，這些細胞符合多能幹細胞的預定特徵，包括復甦後的恢復，通過流式細胞儀測試的多能性標誌物（Oct4，Nanog，Tra1-60，Tra1-81和SSEA4）的表達， EB的形成，遺傳特性與通過STR分析，正常核型分析以及其他標準安全性測試（例如無菌，支原體，病毒安全性和內毒素測試）測試的起始原料的匹配性。
結果證實，我們的iPSC製造工藝是可靠且可重複的，並且可以根據CGMP準則進行操作，從而生成高質量的iPSC，用於製造用於細胞修復性移植策略的臨床級專用細胞。
我們已經證明，在我們過程的每個階段（包括過程開發，培訓和工程運行以及GMP製造運行）中生成的iPSC都可以滿足多能幹細胞的特性，這是通過標準和合格的檢測方法進行評估的。Lonza的iPSC的cGMP生產工藝已通過藥品主文件（DMF號BBMF-16567）提交給美國食品和藥物管理局，在提交研究性新藥申請時可作為參考使用。
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面臨的挑戰
目前幹細胞治療雖然在臨床試驗中總體表現出較好的安全性，但是除了前文所述的生產工藝複雜、質量影響因素眾多外，還存在不少制約其商業化發展的不利因素。
迄今為止,全球範圍內開展了大量的幹細胞臨床試驗，適應證種類可稱得上包羅萬象，涉及關節炎、糖尿病、帕金森病甚至自閉症等，但是，還缺乏大規模、多中心、嚴格平行對照的臨床試驗數據證實其有效性。
眾多臨床試驗普遍缺乏嚴格的臨床前研究。臨床試驗用細胞的基因表達和分化特性往往不十分明確，對治療某適應證時應選擇何種組織來源的細胞產品以達到最佳藥效和安全性的相關研究也很不充分; 在臨床試驗中這些來源於眾多不同部位成體組織的幹細胞在患者體內是否能像治療目的需要的那樣向某種細胞分化通常難以證實。
總之，幹細胞生物製品的商業化成藥研發還處在起步階段，研發者對按藥品管理的細胞產品的研發思路和質量控制策略還缺乏深入的研究，監管機構對於幹細胞產品的理解和認識也在累積的過程中。相信隨著科研水平的進步和細胞治療技術的不斷成熟，在幹細胞治療領域的臨床表現和應用前景將逐步得以明確。
▎文源：幹細胞說；
美賽爾內容團隊編輯。
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廣東美賽爾，總部位於珠三角腹地——佛山，一直秉承以服務「健康中國」為己任，以幹細胞和免疫細胞技術為核心，結合再生醫學、細胞治療、精準醫學、健康管理和大數據等技術，致力於成長為「全民生命健康管理」的高科技企業；建設有符合國家GMP標準、美國血液銀行協會（AABB）標準、國際細胞療法基金會（FACT）標準的臨床級綜合細胞庫和區域細胞製備中心；承擔著以珠三角地帶為核心，覆蓋大灣區的幹細胞和免疫細胞的製備、儲存、研發和應用工作，未來將打造成為細胞儲存容量達到千萬份級的生命銀行；配備了世界一流品牌的細胞製備、培養設備和檢測儀器，自主擁有數十項授權及受理的國家發明專利；目前，廣東美賽爾的產品及服務範圍主要涉及細胞存儲、健康管理、醫美抗衰等領域。