泛素化研究模式很難嗎?我們總結了一份研究小套路~

2021-01-15 博士苑


泛素化是指泛素在一系列酶的催化下對靶蛋白進行特異性修飾的過程，它被認為是蛋白質翻譯後修飾的一個重要途徑，在細胞凋亡、細胞周期調控、DNA損傷修復及膜轉運等細胞過程中起重要作用。



1、從下遊找上遊


2、從上遊找下遊



FBXO38 mediates PD-1 ubiquitination and regulates anti-tumour immunity of T cells.Nature. 

IF：41.577 FBXO38 mediates PD-1 ubiquitination and regulates anti-tumour immunity of T cells.Nature. 2018 Dec;564(7734):130-135.


在正常激活的T細胞中的IL-2信號傳導導致STAT5介導的Fbxo38基因表達的轉錄激活。FBXO38蛋白募集泛素（Ub）修飾內化的PD-1，使PD-1的蛋白酶體降解。T細胞表面上低豐度PD1可最終促進抗腫瘤免疫反應。


 PD-1在蛋白酶體中被泛素化降解 

三種不同T細胞PD-1表達水平-時間變化曲線：激活後的T細胞2天PD-1表達到峰值，之後開始降解，激活後T細胞中PD-1轉錄水平下降不明顯。


IP實驗發現PD-1和泛素相互作用，暗示PD-1被泛素化。


蛋白酶體抑制劑MG132可抑制PD-1的降解；

溶酶體抑制劑NH4Cl則不能。


 FBXO38介導PD-1的Lys48位泛素化降解 

IP實驗驗證：PD-1和FBXO38存在相互作用。


只有同時表達PD-1和FBXO38才可觀察到PD-1泛素化；

調高FBXO38，PD-1泛素化升高，調低則泛素化降低。


 FBXO38調節T細胞抗腫瘤免疫力 

敲除FBXO38的小鼠種瘤之後腫瘤生長更快、小鼠存活時間縮短。


敲除FBXO38後，CD4和CD8 T細胞PD-1表達升高，效應分子陽性CD8 T細胞比例降低，CD8 T細胞增殖能力降低。


 IL-2在腫瘤微環境中拯救Fbxo38的表達水平 

除CD3、CD28抗體激活外，在加入IL-2可進一步提高FBXO38的表達。


ChIP發現IL-2能促進STAT5（IL2的下遊）結合到FBXO38的Enhancer和Promoter上 -IL-2促進FBXO38轉錄的機制。


體內實驗證明：IL-2可通過促進FBXO38的轉錄，抑制PD-1的表達，進而抑制腫瘤的生長。




Long non-coding RNA SNHG15 interacts with and stabilizes transcription factor Slug and promotes colon cancer progression.

IF:6.491 Jiang Hao,Li Tingting,Qu Yi et al. Long non-coding RNA SNHG15 interacts with and stabilizes transcription factor Slug and promotes colon cancer progression.[J] .Cancer Lett., 2018, 425: 78-87..


LncRNA SNHG15與Slug的C末端結構域結合，掩蔽蛋白化位點可阻止BTRC介導的Slug泛素化降解。導致Slug蛋白表達上升，誘導結腸癌中的EMT和/或腫瘤細胞增殖。


 差異表達的lncRNA比較分析 

通過GEO資料庫數據挖掘，結合PCR驗證結果，排除已經有研究報導的lncRNA，最終挑選了SNHG15這一lncRNA。



 LncRNA SNHG15在癌症中失調 

LncRNA SNHG15與癌症不良預後相關，LncRNA SNHG15在癌症中高表達。


 LncRNA SNHG15促進結腸癌細胞遷移 

在細胞表型研究中，作者發現SNHG15能夠顯著促進結直腸癌細胞的遷移。


 LncRNA SNHG15與結腸癌細胞中的Slug相互作用 

IP和RNA pull-down實驗驗證LncRNA SNHG15與Slug相互作用。


確定SNHG15中的Slug結合域 ,Flag-Slug受外源lncRNA SNHG15調控。


 LncRNA SNHG15通過阻止Slug泛素化來穩定Slug 

lncRNA SNHG15上調Slug蛋白水平，對mRNA水平無影響。


驗證LncRNA SNHG15是通過蛋白酶體降解防止Slug降解。


驗證SNHG15能夠抑制BTRC(E3泛素連接酶)介導的Slug的泛素化降解。


 LncRNA SNHG15促進體內腫瘤生長 




本文經授權轉載自公眾號《ZSCI》


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