Cell | 新成像技術揭示呼腸病毒胞內釋放途徑

撰文 | 章臺柳

過去的十年裡，細胞和組織成像方法的發展取得了飛速的進步。利用掃描或透射電子顯微鏡（EM）可以將細胞超微結構成像到2-5nm的解析度，然而EM方法的穿透深度有限，透射EM的穿透深度僅0.5mm。對於較厚的樣品（如哺乳動物細胞）的三維EM成像，可以採用切片和連續重建的方法來克服這一限制，但涉及到樣品的化學處理或複雜的低溫工作流程。

高解析度的3D成像技術——軟X射線斷層成像（soft X-ray tomography，SXT），可以滿足在較厚的玻璃化樣品中對細胞超微結構進行中尺度成像需求，其穿透深度約為10mm，解析度為幾十納米，樣品不需要化學處理【1】。光學顯微鏡可以作為EM和SXT的補充，提供細胞內超微結構、細胞器組織和分子定位的直接信息。將現有的成像方法結合使用組成關聯方案或在生物成像中產生更多的益處。關聯成像通過提供互補的形態、結構和化學信息，對一系列細胞過程提供中澳的新見解，這些信息超出了單獨使用任何一種技術所能獲得的範圍。例如將常規螢光顯微鏡（FM）與EM關聯、將SXT與衍射限制的FM關聯或與涉及化學固定的超解析度FM關聯。

在細胞或組織取得高解析度成像的挑戰之一是保持原始細胞內結構和排列。考慮到這一點，相比於化學固定，快速冷凍成為保持生物結構或細胞內動態過程的黃金標準方法。組織透明化是用於超微結構成像的生物樣品保存的非常有前景的技術，可用於X射線成像、電子斷層掃描、超解析度螢光成像等技術的樣品製備。而且，與室溫成像相比，低溫螢光成像的特點是染料的光穩定性增強，發射光譜更清晰，從而數據具有更好的信噪比。但是，由於目前沒有合適的浸沒液和穩定的浸沒物鏡，cryo-FM系統的數值孔徑（NA）受到限制。低溫螢光成像是通過NA最大值為0.9的空氣物鏡來完成的，限制了可實現的光學解析度，並且低溫條件下成像時防止冰晶形成導致樣品損壞也是一項技術挑戰。

3D結構化光照顯微鏡（3D-SIM）可成為低溫條件下成像的首選方法【2】。SIM利用模式化的光與成像目標的螢光團相互作用，產生低頻幹涉條紋（莫爾效應），攜帶超過系統衍射極限的結構信息，體積解析度提高8倍。SIM在低溫成像上有諸多獨特的「賣點」：1）很容易應用於多通道成像，可使用一系列常見的染料或螢光蛋白；2）可成像相對較厚的樣品，減少了成像前對樣品切片的需要；3）使用相對較低的光劑量和較短的圖像採集時間，最大限度減少對樣品加熱；4）具有非常好的離焦光抑制，即使在厚度為10mm或更高的樣品中也能產生高對比度圖像。最近，SIM與單分子定位顯微鏡組成關聯方案對玻璃冷凍的細胞進行可視化【3】，冷凍置換染色後通過聚焦離子束在相同細胞上進行掃描電鏡成像，取得高解析度成像。如何通過關聯方案的制定實現更多高解析度成像還有待更多的探索。

2020年6月30日，來自英國的Maria Harkiolaki在Cell雜誌上發表文章3D Correlative Cryo-Structured Illumination Fluorescence Microscopy and Soft X-Ray Tomography Elucidates Reovirus Intracellular Release Pathway，通過將高解析度結構化顯微鏡與軟X射線斷層掃描技術組成關聯方案，實現利用X射線和可見光在低溫條件下對細胞進行三維成像。同時利用該方法研究呼腸病毒感染早期，病毒顆粒從細胞內囊泡釋放的過程，鑑定細胞內病毒誘導的結構。

研究人員利用高解析度結構化顯微鏡（cryo-SIM）與軟X射線斷層掃描技術（cryo-SXT）組成關聯方案。定製設計的cryo-SIM是依託於商業化cryo臺的光線束B24，配備長工作距離的空氣物鏡（1003，0.9NA，2mm工作距離，尼康），可提供超過衍射極限解析度的成像。高NA長工作距離的空氣物鏡可確保樣品存放在低溫環境，避免物鏡浸沒到冷凍液中。整個系統有四種照明波長，而且可以更改定製。同時使用向列型液晶空間光調製器用於相位調製模式產生結構化照明（SI）條紋模式，而基於液晶的偏振旋轉器可針對每個條紋方向和激發波長進行獨立優化，不必為下一個優化而損傷其他優化。軟X射線斷層掃描是由全場透射X射線顯微鏡（TXM）改造而來，通過吸收對比度進行成像。TXM選擇k吸收邊緣為284ev的碳和543ev的氧，這樣一個X射線光譜區域作為照明光。這個區域內，富含碳的生物結構比周圍富含氧的介質吸收更多的X射線，由此產生的自然對比度允許在記錄的投射中描繪細胞特徵。細胞膜提供特別強的對比度，使得膜結合的細胞器特別容易在相對較厚的整個細胞的超微結構3D斷層圖像中被識別。同時，通過在樣品室的20X物鏡和寬光譜LED照明，TXM具有基本的可見光顯微鏡能力，可對先前由常規或超解析度光學顯微鏡識別的感興趣區域（ROI）進行定位和標記。

那麼，cryo-SXT和cryo-SIM關聯方案的工作流程具體如何？待成像的細胞通常生長為貼壁單層、多層或懸浮，貼壁細胞培養在金EM網格的碳膜上。在該階段，可內源性表達螢光標記物或添加到培養基中被細胞攝取。通過多種傳統的光鏡和螢光顯微鏡方法確定培養基中或細胞的附著、生長、融合和分布，然後添加基準標誌物（通常是金納米珠）、印跡（去除多餘的培養基）和插入液氮冷卻的液體乙烷中進行玻璃化冷凍。玻璃化後，網格在明場和螢光中成像，並在裝有螢光檢測功能的冷凍級光學顯微鏡上繪製光束線，檢查細胞形態，鑑定感興趣區域ROI，確認無非玻璃汙染物。因此，Cryo-SIM是高解析度3D成像的第一步，cryo-SXT隨後，兩者的順序不可倒置。樣品放置於標準的Linkam低溫保持器中，cryo-SIM首先生成網格保持器結構的明場透射2D鑲嵌圖，同時注釋ROI，3D-SIM數據收集沿著樣品z-軸進行採樣。Cryo-SIM數據收集後，將樣品從Linkam支架中恢復並儲存網格，直到可以加載到TXM支架中。利用可見光檢查和繪製網格，恢復SIM數據採集中建立的ROI，以便在相同的區域進行X射線數據採集。初步評估樣品對輻射損傷的敏感性和玻璃化的均勻性，隨後制定數據收集策略並收集3D射線數據。利用eC-CLEM對收集的cryo-SIM和cryo-SXT數據進行計算並構建高解析度成像。

最後，研究人員利用該技術對呼腸病毒感染的早期進行成像研究。呼腸病毒（reovirus）是無包膜的二十面體病毒，不具有細胞膜融合能力，其核心如何到達細胞質啟動複製至今仍不清楚。之前的研究顯示，呼腸病毒通過clathrin介導的內吞作用進入細胞，隨後通過內吞小體從早期的Rab4-、Rab5-或Rab11-陽性內吞小體運輸到Rab7-或Rab9-陽性內吞小體。Cryo-SIM數據成像出呼腸病毒早期感染的事件，感染後1h，內吞的呼腸病毒顆粒已經開始破壞吞內小體的膜結構，受影響的內吞小體繼續進展到後期。Cryo-STX數據觀察到：1）所有時間點（感染後1、2、4h）的細胞都攜帶病毒載量的簡單囊泡群；2）一些囊泡逐漸變大，並產生多個囊泡體（MVB），這些囊泡體位於遠離細胞外圍靠近細胞核的地方。MVB在感染2h開始可見，並在4h內持續增長；3）攜帶富含碳的圓頂型結構的囊泡亞群。這些結構都只在感染2h的細胞中出現，在對照細胞的細胞質中不存在。

總的來說，文章開發了cryo-SIM和cryo-SXT的關聯方案，用於低溫條件下對細胞的高解析度成像，並且用呼腸病毒的感染研究對關聯方案的可用性進行驗證，為細胞和組織成像研究提供了新的工具。

原文連結：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.05.051