《二十四型》的上期課程已經介紹了泛素化的基本概念、泛素-蛋白酶體系統中各組分以及該系統在生理過程中的重要作用。
而本期課程則將繼續聚焦泛素化，並針對泛素化的信號通路調控作用、所介導的病理過程、藥物研發和研究實驗手段進行了詳細講解。
很多信號通路，如AKT-mTOR通路、Hippo-YAP通路和NF-κB通路，都會採用泛素化降解的方式關閉信號傳導，因此泛素化過程對於信號通路的調控非常重要。
1）在AKT-mTOR通路中，兩個E3泛素蛋白連接酶TRAF6和SKP2，可促使AKT的第8和14位的賴氨酸發生K63型的泛素化，進而促使AKT定位於細胞膜上，只有如此AKT才會被相應的激酶激活，從而在細胞內傳導信號。
而去泛素化酶CYLD則能特異性地去除AKT的泛素化標記。此外，CHIP、Nedd4、TTC3也能夠通過K48型的泛素化降解途徑降解AKT來關閉AKT-mTOR信號通路。
2）在Hippo-YAP通路中，當細胞配體Dchs1/2和受體Fat4結合後，可依次激活激酶MST1/2和激酶LATS1/2，磷酸化轉錄調控因子TAZ和YAP 後與14-3-3蛋白結合，可阻止TAZ/YAP與轉錄因子TEAD相互作用，負調控下遊基因轉錄以限制組織的過度生長（圖1）。
圖1：Hippo信號通路示意圖
其中，E3酶CRL4DCAF1和SIAH2能分別促進LATS1和LATS2的泛素化降解過程，從而抑制Hippo信號通路。而SIAH2還起到連接HIF1α信號通路和Hippo信號通路的作用。
3）在NF-κB通路中，抑制因子IκB結合併抑制胞漿內的NF-κB的功能。當IKK激活後，IκB被磷酸化且在E3酶β-TRCP的作用下發生K48型的泛素化修飾；在IκB被降解後，可使NF-κB進入核內以激活下遊基因的表達。
另外，E3酶TRAF6泛素化激活TAK1複合物，進而可順次激活IKK以及NF-κB通路；而去泛素化酶A20可和RNF11、ITCH和TAX1BP1形成複合物，以去除TRAF6形成的K63型的泛素鏈，避免NF-κB信號通路過度激活。
圖2：NF-κB信號通路示意圖
1、泛素化異常與惡性腫瘤
目前泛素化異常主要是通過三條途徑引發惡性腫瘤的發生：
1）調控細胞周期蛋白的穩定性。泛素化異常可致使細胞周期相關蛋白表達紊亂和細胞周期失控，最終導致細胞癌變；
2）調控腫瘤抑制因子的表達。當泛素-蛋白酶體系過度激活時，p53蛋白會被過度泛素化降解，表達量過低，則無法起到抑癌基因的作用；
3）參與調控多條關鍵的信號通路。泛素化異常可導致信號通路發生異常，致使細胞癌變。
2、泛素化異常與神經退行性疾病
異常蛋白的積聚和沉積（如阿爾茨海默病的tau蛋白和β-澱粉樣蛋白）是神經退行性疾病的共同病理機制，而已有研究證明泛素化異常可能是導致神經退行性疾病的主要原因。因而激活蛋白酶體、增強其對錯誤摺疊蛋白質的降解能力，已經成為治療神經退行性疾病的一種可能的方法。
因此，近年來泛素化過程已經逐漸成為了腫瘤的治療靶點，因而泛素-蛋白酶體系統中的關鍵組分開發相應的抑制劑在臨床上具有重要的意義。
1）針對泛素蛋白連接酶E3的藥物
因泛素蛋白連接酶E3能夠特異性識別待降解的底物，因此，目前針對E3酶的藥物研發是整個泛素化過程中最為受到關注的領域。
在人類基因組的眾多E3酶中，以MDM2、E6AP、SKP2、Nedd4和Fbw7為基礎的研究最為常見。
MDM2能促進p53蛋白的泛素化降解，可阻斷由p53介導的細胞周期阻滯或細胞凋亡。第一個以E3酶MDM2為靶點的小分子抑制劑Nutlin則首先被研發出來，但Nutlin對含有突變型p53的腫瘤細胞往往效果不佳。
SKP2可識別並泛素化降解很多的腫瘤抑制因子，如p21、p27、鈣粘蛋白（cadherin）、FOXO1，誘導細胞發生癌變。
在以SKP2為靶點的抑制劑中，Cpd A可通過阻止SKP2進入SCF(Skp1-Cul1-F-box) E3酶複合物，並抑制SCF複合物的功能，能引發腫瘤細胞的G1/S期細胞周期阻滯和誘導腫瘤細胞發生凋亡。
另一種抑制劑SMIP0004則能下調SKP2的表達水平，從而誘導前列腺癌細胞G1期細胞周期阻滯，抑制細胞的增殖和集落的生成。
2）針對蛋白酶體的藥物
用蛋白酶體抑制劑處理腫瘤細胞，可打破腫瘤細胞內部促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之間的平衡，誘發腫瘤細胞的周期阻滯和細胞凋亡現象。因此，蛋白酶體抑制劑被認為是克服化療增敏、遏制腫瘤細胞擴散的有效靶點。
目前，第一代蛋白酶體抑制劑硼替佐米(Bortezomib)和第二代蛋白酶體抑制劑卡非佐米(Carfilzomib)在治療多發性骨髓瘤和淋巴瘤等方面已有不錯的療效。
1）生物信息學分析
目前關於蛋白的泛素化修飾，數據收錄最為齊全的是Uniprot資料庫（網址：https://www.uniprot.org/），它會根據發表的文獻收錄蛋白翻譯後修飾相關的信息，以供網友們查詢。
點擊「PTM/Processing」就可顯示出所有文獻中報導的和p53相關的翻譯後修飾的類型和發生修飾的位點以及相應的文獻。
顯然，對於p53而言，發生泛素化的位點有兩處：291位和292位。如果想要深入了解相關信息，可以點擊旁邊的publication按鈕即可。
然而Uniprot資料庫並不是一個專門只收集蛋白泛素化信息的資料庫，因此Uniprot資料庫在泛素化信息收集的專業性方面還存在諸多的不足。除了Uniprot資料庫之外，還有一些專門收集蛋白泛素化信息的資料庫：UbiProt、E3Net和 hUbiquitome。
UbiProt (http://ubiprot.org.ru/) 是一個收錄泛素化修飾底物蛋白的資料庫。其中每個數據條目都是通過人工手動的方式進行提取並注釋的，描述了特定的泛素化底物蛋白信息，如蛋白的性質、物種來源、泛素化修飾特徵、參考文獻及相關連結等。其數據來源於一些大規模組學實驗數據，而其餘的底物蛋白數據是從針對特定蛋白的泛素化修飾實驗研究中得到的。
E3Net資料庫 (http://pnet.kaist.ac.kr/e3net/)是當前泛素化修飾相關蛋白資料庫中最為出色的，共收錄了427個物種中2201個泛素化修飾E3及4896個底物蛋白信息，其中包含493個E3與1277個底物蛋白之間的1671個特異選擇關係。該資料庫的數據來源主要是文本挖掘方法挖掘MEDLINE摘要得到的結果、UniProt相關條目注釋信息、公共泛素化資料庫收錄數據以及高通量實驗數據。
hUbiquitome (http://bioinfo.bjmu.edu.cn/hubi/)旨在收錄高可信度的實驗驗證的人類泛素化相關蛋白質，共收錄了1個E1、12個E2、138個E3、279個底物蛋白以及17個去泛素化酶。該資料庫規模較小，但可信度較高，由於收錄的全部為實驗驗證的數據，且為人工手動錄入，提高了資料庫所收錄數據的可靠性。
2）泛素化的實驗研究
通過高通量手段進行泛素化蛋白的檢測。先提取蛋白樣本後進行胰酶酶解，隨後進行HPLC分級。再利用可以結合併純化泛素化底物的抗體，富集所有被泛素化標記的蛋白片段。最後進行質譜分析、數據處理和生物信息學分析。此方法都是由專業的公司來完成的。
鑑定E3泛素蛋白連接酶。因只有E3泛素蛋白連接酶才具有底物識別的特異性，則在研究底物的泛素化過程時，找到並且驗證E3酶是最為重要的工作。
而要驗證底物和E3泛素蛋白連接酶之間的關係，至少需要證明兩個方面：1.通過Co-IP或者酵母雙雜交驗證E3酶和底物之間能夠相互結合；
2.採用體外泛素化實驗（In vitro ubiquitination assay）驗證E3酶能介導底物的泛素化。即在體外將E1 酶、E2 酶、E3 酶、底物和標籤標記（Myc tag和His tag）的泛素分子混合後並進行孵育，再通過SDS-PAGE以及標籤蛋白的抗體（myc抗體或者His抗體）來檢測被泛素化標記的底物分子。
又因底物可被單個或多個泛素標記，而且底物上的泛素鏈長度有長有短，並不均一。因此通過標籤抗體檢測到的底物分子，往往呈現出一片smear 的形態（如圖3）。
圖3：E3 酶介導底物泛素化的典型western 結果圖。圖中RHA2b是E3 酶，MYB30是底物分子。
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