PCR擴增失敗,這個原因您想到過嗎?

2021-01-09 騰訊網

引 言

炎症性腸病(Inflammatory Bowel Disease, 簡稱IBD)是一組特定的腸道慢性疾病的統稱,主要包括克羅恩病和潰瘍性結腸炎兩種。IBD的特徵是慢性和復發性胃腸道炎症,其可增加患結腸炎相關癌症的風險。

化學致炎劑DSS 是一種人工合成的硫酸鹽多糖,小鼠經飼餵含有DSS 的飲水可以形成炎症性腸病模型( 簡稱DSS 模型)。其病理改變接近人類潰瘍性結腸炎(UC),往往出現以血便、腸道黏膜潰瘍和粒細胞浸潤為特徵的結腸炎症。

DSS模型構建相對簡單且經濟,廣泛用於篩選治療炎症性腸病(IBD)的新方法和臨床前新藥物的開發,也用於研究IBD的發病機制,在生物學研究中被廣泛使用。

DSS知多少?

DSS(Dextran sulfate sodium),中文名:硫酸葡聚糖鈉

產品名稱:硫酸葡聚糖鈉

別名:葡聚糖硫酸酯鈉,DSS,右旋糖酐硫酸酯鈉,葡聚糖硫酸鈉鹽

英文名稱:Dextran sulfate sodium

CAS No.:9011-18-1

結構

但DSS抑制PCR反應的現象已被廣泛關注,有多篇文獻報導過。如果不對樣本做額外的處理,可能導致PCR失敗或數據失真,導致得出錯誤的結論。

DSS造成的影響?

1、DSS處理並不會導致組織樣本DNA和RNA完整性改變。

2、DSS處理對PCR擴增造成了嚴重的抑制。DSS處理組的樣本PCR擴增沒有特異條帶。

另外,腸道微生態的改變也是很多老師利用DSS模型研究的內容之一。DSS處理的樣本對16srDNA的擴增也有很大的影響。

降低DSS影響的辦法

DSS模型樣本需要經過怎樣的處理才能降低PCR的抑制呢?

1、RNA層面 用LiCl對抽提好的RNA進行純化

經過LiCl處理的RNA樣本能特異性的擴增出目的產物。

2、DNA層面

研究表明,帶有高價陽性電荷的精胺能有效中和陰性電荷的DSS分子,通過添加一定量的精胺能有效抑制DSS對PCR擴增的影響。

DSS濃度和精胺濃度都會對後期的PCR反應造成不同程度的影響,需要對樣本處理條件做一定的優化。

歐易生物經過多輪測試,針對DSS處理的糞便樣品研發出獨特的純化方案,PCR成功率得到極大提升。

圖1 | DSS處理樣品未純化

圖2 | DSS處理樣品純化後

疫情終會過去,歐易持續為您服務幫您「充電」,樣品交到我們手上必將給您一個滿意的結果!

參考文獻:

1. Thouvenot, Pierre at el. Have you tried spermine? A rapid and cost-effective method to eliminate dextran sodium sulfate inhibition of PCR and RT-PCR. JOURNAL OF MICROBIOLOGICAL METHODS, Volume 144, Number 1, 2018, pp. 29-32(4)

2.Emilie Viennois at el. Dextran sodium sulfate inhibits the activities of both polymerase and reverse transcriptase: lithium chloride purification, a rapid and efficient technique to purify RNA.BMC Research Notes 2013, 6:360

相關焦點

  • pcr擴增的原理和步驟
    pcr擴增在做實驗的時候是經常用到的,它是基礎實驗,是每個做實驗的人都應該掌握的,下面小編就來說一下PCR擴增的原理和步驟吧。1.pcr擴增的基本原理是PCR技術和DNA的天然複製過程基本是一樣的,其靶序列兩端互補的寡核苷酸引物與其特異性依賴於與DNA的半保留複製。
  • 我叫極速PCR試劑盒,這是我的說明書
    【適用人群】   不管您是男是女,是生物教師還是生物實驗員,只要您想順利攻克分子生物學實驗之基因片段的擴增,選擇極速pcr試劑盒包您藥到病除。   【功能主治】   模板、引物自行設計難度大,精準度要求高——您的工作我們做,直接使用更便捷。
  • 知識點:德國MB螢光定量pcr檢測原理
    螢光定量PCR法(qPCR):是在常規PCR基礎上,將『針對支原體特異性保守序列的探針』做螢光標記,使PCR擴增後的產物帶有螢光,利用螢光信號的變化和配套軟體,進行DNA擴增反應的實時監測,簡稱qPCR。本文締一生物為您做以下分析。
  • 疾控中心PCR實驗室建設標準
    2、PCR實驗室基本由五大結構組成,常見為:pcr走廊、準備區、製備區、擴增區和擴增分析區。3、基本功能介紹:3.1準備區、實驗所需試劑的準備工作,分裝等,由傳遞窗運送至製備區,嚴謹走人員通道。3.3擴增區、dna的擴增,以製備的dna模版和合成的cDNA的加入和主板反應混合液製備成反應混合液等也可在擴增區內進行,在巢式pcr測定中,通常在第一輪擴增後必須打開反應管,因此巢式擴增有較高等汙染危害性,第二次加樣必須在本區完成。
  • 擴增子裡妥妥的C位是它,你想到了嗎?
    所謂擴增子,簡單地理解,就是經過人工擴增的DNA片段或RNA片段的擴增產物。擴增子測序主要包括16S rDNA測序、18S rDNA測序、ITS測序及目標區域擴增子測序等。今天要向大家介紹的是擴增子裡的C位——OTU君。
  • 消滅PCR非特異性擴增的黃金方法
    雖然度過了初學者們少加漏加PCR體系的階段,但很多奮戰在實驗室一線的小夥伴正遭遇著PCR非特異性擴增的尷尬事件。為了解決這個問題,有多少人曾經把退火溫度從50℃試到70℃、重新合成過引物、換過模板、換過全新的電泳緩衝液,或者還帶著滿腔的憤怒捏碎過電泳膠?今天老談來教教大家如何對非特異性擴增嗤之以鼻!
  • PCR擴增分離目的DNA片段
    (5)引物濃度不宜偏高,過高易形  成二聚體,而且擴增微量靶目標或起始材料是粗製品,容易產生非特異產物。3、緩衝液:PCR緩衝液的變化通常會影響擴增結果,特別是MgCl2,其濃度對專一性和擴增量有重大影響,通常最適濃度為1.5mM左右(每種dNTP 的濃度為0.2mM時),濃度過高,使反應特異性降低;濃度過低,使產物產量降低。
  • 我的PCR擴增不粗來,要怎麼辦呢?
    好了,這個我相信不用我詳細介紹了。最近實驗一直很不順利,唉……連PCR我都擴增不出來了。事情是這樣的,老闆給了個家系調查的課題,但這種課題只能抽點血樣來進行,測個突變啊啥的。但給我的血樣都已經有點發黑了,我覺得絕壁是這個問題,肯定是樣品變質了,才會導致我PCR沒法P出來的。
  • 知識點:德國MB螢光定量pcr檢測原理
    螢光定量PCR法(qPCR):是在常規PCR基礎上,將『針對支原體特異性保守序列的探針』做螢光標記,使PCR擴增後的產物帶有螢光,利用螢光信號的變化和配套軟體,進行DNA擴增反應的實時監測,簡稱qPCR。本文締一生物為您做以下分析。
  • RT-PCR的指數擴增
    它是一種以 RNA 為樣本,RNA鏈被逆轉錄成為互補DNA(cDNA),再以此為模板通過 PCR 進行 DNA 擴增。圖源:百度百科一、RT-PCR的指數擴增RT-PCR的指數擴增是一種很靈敏的技術,可以檢測很低拷貝數的RNA。
  • PCR及其它核酸擴增技術
    核酸體外擴增是分子生物學研究的基礎。隨著生物技術的發展, 出現了越來越多的核酸體外擴增技術。根據其特點可分為三類: 一類是靶核酸的直接擴增, 如聚合酶鏈式反應等; 一類是探針擴增技術,如Cleavase/Invader Technology;另一類是信號放大擴增, 如HC2。
  • RT-PCR與qPCR所需要的引物區別
    原理不同:螢光定量PCR實時監測與DNA結合的螢光染料激發的螢光;普通pcr通過檢測插入dna中螢光染色劑來看是否有目的片段。   應要求:螢光定量對擴增片段有較高的要求,一般為100-300bp;普通PCR可以擴增長點的片段。螢光定量可以不進行電泳就對產物進行定量分析,普通PCR必須電泳。
  • PCR技術:用PCR擴增cDNA庫中的特異序列
    雖然這個方法已成功地克隆了大量基因,但建立和篩 選CDNA庫是一項非常耗時.費力的工作,而且用寡聚核苷酸作探針進行篩選需大量蛋 白質序列結構的資料。聚合酶鏈的反應(PCR)方法可使一種特異DNA擴增幾百萬倍, 並已成為分子克隆和診斷的十分有用的工具。最近,TAQDNA聚合酶的使用極大地簡化 了PCR方法。
  • 臨床基因擴增PCR實驗室
    Pcr實驗室又叫基因擴增實驗室、DNA實驗室,基因檢測實驗室。PCR是聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)的簡稱。是一種分子生物學技術,用於放大特定的DNA片段,可看作生物體外的特殊DNA複製。
  • 很多人願意教您成功,為什麼沒人願意教您失敗呢?原來是這個原因
    成功,我想每個人都希望達到的事,證明了自己的能力,成就等等,所以我們進入社會,很多的人不斷的說,你一定要成功,一定要做到,這樣您能達到更大的成功等等。那為什麼沒有人給說失敗呢??其實小編認為,不管中國還是全世界,很多人都願意成功,不願意失敗,還是人的心理作用吧。
  • 查爾酮合成酶基因的PCR擴增
    【實驗目的】(1)掌握PCR擴增的基本原理。(2)掌握PCR擴增查爾酮合成酶基因的方法及操作過程。(3)了解查爾酮合成酶的功能及基因相關信息。(4)熟練掌握瓊脂糖凝膠電泳的操作過程。模板DNA經若干個變性、退火和延伸循環後,目的基因擴增為原來的2n倍。 【實驗材料、試劑及儀器】1.實驗材料白菜、甘藍、芥藍等蕓薹屬蔬菜的基因組DNA(20ng/μL)。
  • PCR實驗室建設要求及防控建議
    聚合酶鏈鎖反應,Polymerase chain reaction,簡稱PCR,是一種分子生物學技術,用於擴增特定的DNA片段,這種方法可在生物體外 進行,不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。(一)PCR實驗室平面布局PCR實驗室原則上分為4個單獨的工作區域,由擴增前區到擴增後區,且要嚴格分開。實驗材料、試劑、記錄筆、紙、清潔材料等,只能從擴增前區流向擴增後區,即從試劑製備區--樣品製備區---擴增區---擴增產物分析區,不得逆向流動。實驗室的氣流也應從擴增前區流動到擴增後區,不得逆向流動。
  • 這個城市居然是八邊形?@您去過嗎?
    卓然秀秀出你姿態卓然秀已經兩歲了您對我有什麼意見和建議嗎今日話題:如果你也聽說:影響一個城市形狀的因素有很多,有地理原因,有經濟因素,也有歷史原因,但是大多數城市的形狀都是不規則形的。可是,網上有傳言稱,在新疆的伊犁,有一個叫特克斯的城市,整個城市的形狀是標準的八邊形。消息一出,立刻引起大家的關注。
  • 目的基因的PCR擴增
    ⬇ 94℃ 30s   55℃ 30s             }  30cycles       72℃ 1min         ⬇72℃ 10min         ⬇4℃ forever 3、  檢測PCR產物取5μlPCR擴增反應液