2015年1月21日 訊 /生物谷BIOON/ --免疫療法（immunotherapy）是最近新興的一種癌症治療手段，其目的在於引導患者產生針對癌症細胞的特異性免疫反應。在最近的研究中，這種方法配合傳統的手術與放射治療具有出明顯的優勢。然而，作為基因突變的產物，癌細胞與人體正常細胞的特徵十分相似，因此在誘導癌細胞特異性免疫反應過程中"自體免疫耐受"成為不可忽視的影響因素。
TIM-3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3）是一類T細胞表面抑制性分子，能夠引起癌症與慢性病毒感染過程中T細胞的衰竭。與CTLA-4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4），PD-1（programed death-1）相同，TIM-3也是目前研究最多的免疫治療的靶點之一。因此，TIM-3引導免疫耐受的機制十分值得研究。最近哈佛大學醫學院Richard S. Blumberg課題組在《自然》雜誌發表了他們對TIM-3引導免疫耐受的機制的研究。
首先作者根據之前發現的實驗現象："T細胞表面表達CEACAM-3蛋白，這一蛋白可以介導免疫耐受"，利用OT-II小鼠（該小鼠CD4+ T細胞特異性識別OVA蛋白323-339的多肽）以及Ceacam-1（carcinoembryonic antigen cell adhesionmolecule-1）缺失突變OT-II小鼠建立免疫耐受模型。實驗結果顯示，OVA323-339多肽能夠引發野生型OT-II小鼠產生免疫耐受（即CD4+ T細胞增殖受到抑制），然而，Ceacam-1-/- OT-II小鼠則沒有出現免疫耐受的現象。之後，作者通過過繼移植（adoptive transfer）的方法將CFSE標記的OT-II na?ve CD4+T細胞（這種標記手段可以實現通過流式檢測分析細胞增殖情況）分別轉移入野生型與Ceacam1-/- 小鼠體內，並輔以OVA323-339多肽的刺激。之後的流式分析顯示：導入Ceacam-1-/- 小鼠體內的OT-II na?ve CD4+T細胞其增殖能力明顯高於野生型小鼠。出人意料的是，作者發現這部分CD4+T細胞中TIM-3的表達與Ceacam-1的表達具有非常強的相關性。暗示了T細胞表面TIM-3與Ceacam-1存在共表達的特性。
由於TIM-3的配體之前一直不清楚，作者猜想是否TIM-3與Ceacam-1在T細胞表面存在相互作用。作者在HEK293細胞系中過表達hTIM-3與hCeacam-1蛋白，後續的免疫共沉澱實驗證明兩者存在相互作用，而且TIM-3或Ceacam-3內部若干胺基酸殘基的突變會減弱這種相互作用。作者通過結晶學的手段得到了TIM-3與Ceacam-3的共結晶結構，結果顯示TIM-3與Ceacam-1在N-端具有非常強的相互作用。至此，生化方式最終證明了兩者的關係。
通過代謝標記的方式，作者發現Ceacam-3的存在會增強TIM-3的表達，然而當ceacam-3或TIM-3發生突變後，TIM-3會出現過度的糖基化，並且失去上膜的能力，在細胞內部過度積累。隨後，通過比較TIM-3tg，TIM-3tg Ceacam-1-/-小鼠TIM-3在SEB（superantigen staphy2 Tolococcal enterotoxin B，一類可以引起免疫耐受的抗原，作用於OVA類似，但不需要特異性T細胞轉基因小鼠）刺激前後的表達水平以及分布情況，發現TIM-3tg小鼠CD4+ T細胞TIM-3在接受刺激後表達量上升，並且上膜效率提高（通過生化與流式分析手段證明），顯示出免疫耐受的特性；然而，TIM-3tg Ceacam-1-/-小鼠T細胞TIM-3的表達量與分布則沒有如上變化。
在此工作的基礎上，作者分析了的TIM-3與 Ceacam-1參與免疫耐受分子機制。作者通過對野生型CD4+T細胞進行Anti-CD3&Anti-CD28的體外刺激，並分別接受N- Ceacam-1的體外刺激與空白處理。結果顯示，對照組T細胞出現大量增殖，而N- Ceacam-1刺激後的細胞對Anti-CD3&Anti-CD28的刺激不再敏感。這一結果證明了Ceacam-1負向調控的能力。那麼這一作用是否需要TIM-3參與呢？BAT-3是TIM-3下遊的一個抑制性分子，它可以與TIM-3進行結合從而抑制TIM-3的活性。作者比較了TIM-3tg（對SEB免疫耐受敏感）以及TIM-3tg Ceacam-1-/-（對免疫耐受不敏感）的小鼠CD4+ T細胞在接受上述刺激之後TIM-3與BAT3的相互作用情況。免疫共沉澱結果顯示：在接受刺激之前，兩組細胞具有相當的相互結合能力，但在N- Ceacam-1刺激之後，TIM-3tg 小鼠 T細胞中TIM-3與BAT3的相互作用減弱，說明TIM-3得到了活化；而在TIM-3tg Ceacam-1-/-小鼠T細胞中兩者的相互作用反而增強了。以上結果說明了Ceacam-1通過TIM-3信號通路影響了T細胞的免疫耐受。
那麼體內真實的情況是怎樣的呢？作者通過過繼轉移的方式向Ceacam-1-/- Rag 2-/-小鼠體內注入野生型的na?ve T細胞，導致了大腸的炎症反應。之後，作者對大腸部位浸入的T細胞的進行了特徵分析。結果顯示：TIM-3+ Ceacam-1+細胞IL-2，IFN-γ，IL-17A等效應性分子標記表達量遠遠低於其它類群的細胞。同時，當注入的是Ceacam-1-/- T細胞時，這群細胞TIM-3的表達量遠低於野生型細胞，而且同時TNF-α的表達量也開始增強。作者進行了其它一些病理指標的分析，證明Ceacam-1促進了小鼠的免疫耐受反應。
最後，作者研究了Ceacam-1以及TIM-3在腫瘤特異性免疫反應過程中的作用。研究發現：在人工誘導的小鼠大腸癌模型中，Ceacam-1+TIM-3+細胞的比例遠高於其它類群的CD4+ T細胞，同時，Tim3tg小鼠對大腸癌的致死率是100%，遠高於野生型小鼠及Ceacam-1-/-小鼠。其它一些病理指標與體外檢測同樣表明Ceacam-1與TIM-3抑制了T細胞對癌細胞的免疫反應。
綜上，作者通過一系列遺傳學與免疫學手段證明Ceacam-1與TIM-3聯合作用導致T細胞對各類疾病產生免疫耐受。其下遊的信號傳遞方式還需要進一步研究。
免疫耐受是一把"雙刃劍"，在自身免疫病中，耐受具有積極的作用，而在癌症發生過程中，免疫耐受卻存在消極的影響。作為與PD-1，CTLA-4相似的分子，CEACAM-1與TIM-3也是免疫治療與藥物開發領域熱門的靶點分子。希望我們將來可以在全方面的了解的基礎上，針對不同的疾病（癌症，自身免疫病）設計相關藥物，達到治癒的目的。（生物谷bioon.com）
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CEACAM1 regulates TIM-3-mediated tolerance and exhaustion
Yu-Hwa Huang, Chen Zhu, Yasuyuki Kondo, Ana C. Anderson, Amit Gandhi, Andrew Russell, Stephanie K. Dougan, Britt-Sabina Petersen, Espen Melum, Thomas Pertel, Kiera L. Clayton, Monika Raab, Qiang Chen, Nicole Beauchemin, Paul J. Yazaki, Michal Pyzik, Mario A. Ostrowski, Jonathan N. Glickman, Christopher E. Rudd, Hidde L. Ploegh, Andre Franke, Gregory A. Petsko, Vijay K. Kuchroo & Richard S. Blumberg
T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-3 (TIM-3, also known as HAVCR2) is an activation-induced inhibitory molecule involved in tolerance and shown to induce T-cell exhaustion in chronic viral infection and cancers1, 2, 3, 4, 5. Under some conditions, TIM-3 expression has also been shown to be stimulatory. Considering that TIM-3, like cytotoxic T lymphocyte antigen 4 (CTLA-4) and programmed death 1 (PD-1), is being targeted for cancer immunotherapy, it is important to identify the circumstances under which TIM-3 can inhibit and activate T-cell responses. Here we show that TIM-3 is co-expressed and forms a heterodimer with carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 1 (CEACAM1), another well-known molecule expressed on activated T cells and involved in T-cell inhibition6, 7, 8, 9, 10. Biochemical, biophysical and X-ray crystallography studies show that the membrane-distal immunoglobulin-variable (IgV)-like amino-terminal domain of each is crucial to these interactions. The presence of CEACAM1 endows TIM-3 with inhibitory function. CEACAM1 facilitates the maturation and cell surface expression of TIM-3 by forming a heterodimeric interaction in cis through the highly related membrane-distal N-terminal domains of each molecule. CEACAM1 and TIM-3 also bind in trans through their N-terminal domains. Both cis and trans interactions between CEACAM1 and TIM-3 determine the tolerance-inducing function of TIM-3. In a mouse adoptive transfer colitis model, CEACAM1-deficient T cells are hyper-inflammatory with reduced cell surface expression of TIM-3 and regulatory cytokines, and this is restored by T-cell-specific CEACAM1 expression. During chronic viral infection and in a tumour environment, CEACAM1 and TIM-3 mark exhausted T cells. Co-blockade of CEACAM1 and TIM-3 leads to enhancement of anti-tumour immune responses with improved elimination of tumours in mouse colorectal cancer models. Thus, CEACAM1 serves as a heterophilic ligand for TIM-3 that is required for its ability to mediate T-cell inhibition, and this interaction has a crucial role in regulating autoimmunity and anti-tumour immunity.