慢病毒載體穩定性和效率較高，且能整合進基因組中穩定遺傳，因此在過繼細胞治療中被廣泛使用。但在生產中仍然暴露出慢病毒載體的許多不足之處，如包裝過程耗時久、成本高、工藝繁瑣、質控複雜，導致目前應用中的細胞治療產品製備周期較長且成本居高不下，因此開發一種更高效便捷的非病毒基因遞送系統很有必要。
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什麼是轉座子？
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轉座子系統是近些年來逐漸在細胞治療領域得到應用的一種非病毒基因遞送系統。常見的轉座子系統有睡美人轉座子（Sleeping Beauty，SB），PB轉座子（piggyBac）和Tol2等，目前SB和PB兩款系統在過繼細胞療法中得到應用，其中SB的應用案例要遠多於PB轉座子系統。有綜述對截止到2020年5月涉及到轉座子的細胞療法臨床研究進行了總結，可以看到只有3項臨床研究使用了PB轉座子，而使用SB轉座子的臨床研究多達10項。
轉座子的作用模式很簡單，兩個部分最為關鍵：轉座酶（transposase）和目的基因（gene of interest，縮寫為GOI，GOI兩端連接著可以結合轉座酶的特異性序列ITR）。以下圖中的SB轉座子為例，轉座酶在細胞內表達後會分別結合在GOI兩端的ITR序列上結合併將GOI切下，剪切後的GOI-transposase複合物則會尋找基因組上富含TA的區域並將GOI整合至基因組上。有學者將轉座子系統翻譯為「跳躍基因」，這個詞十分形象。
在實際的應用中，轉座子系統一般需要使用分別編碼目的基因和轉座酶的兩個質粒，然後將其共同轉染至分離出的T細胞中，而非使用單個質粒承載目的基因和轉座酶。這樣做的好處是可以對目的基因和轉座酶的比例進行調整，從而對目的基因的整合效率進行優化。普通的轉染試劑在T細胞中的轉染效率極低，因此目前大多採用電轉儀進行轉染。
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轉座子系統較病毒載體的優勢
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與病毒載體相比，轉座子是以質粒的形式進入細胞，而質粒在大規模生產、質控、放行檢測等方面相對於病毒生產來講顯然優勢巨大（如下圖所示）。使用細胞株生產病毒成本較高且難以放量，病毒的純化過程也極為繁瑣，耗時更達2-3周之久；而生產質粒使用的是易於培養且成本低廉的大腸桿菌系統，後續純化工藝也簡單不少，耗時可以短至7-10天。
除了成本和時間上的優勢外，轉座子系統在遞送能力、整合方式等方面還具有一些獨特的優勢。慢病毒載體的包裝能力約為8kb，但其中病毒自身序列需要佔據一定的長度，留給目的基因的長度只有4kb左右；而經過合理優化的轉座子可以遞送長達11kb的目的基因。從整合方式上來看，慢病毒和逆轉錄病毒在整合位點上具有偏向性，如lentivirus偏向於整合到活躍表達的gene body中，逆轉錄病毒傾向於整合至基因的promoter區域，這些偏向性都有一定的概率引起整合位點附近基因表達的異常，因而很長一段時間以來人們都在擔心病毒載體的致瘤風險。與病毒載體相比，轉座子的整合基本上不存在什麼偏向性（a close-to-random integration pattern）：SB轉座子整合至TA序列富集區域，而PB轉座子會整合至TTAA序列區域，對整合位點附近基因表達的影響大大降低。
上一段中提到了轉座子在安全性上存在一些優勢，這裡需要說明的是，即使轉座子系統似乎比病毒載體更加安全，但也並不是絕對的安全。NCT00968760臨床研究對接受轉座子系統整合的CD19 CAR-T治療的患者在細胞回輸約5年後進行了隨訪（2020年3月發表在Blood雜誌上），雖然並未發現嚴重的安全性問題，但畢竟轉座子系統只是整合偏向性較低，理論上來講只要能夠插入基因組就有引發癌變的風險。與隨機整合模式相比，將外源基因整合到基因組中某個低風險區域的定點整合技術更具開發潛力。2020年3月份發表在eLife雜誌上的一篇文章使用dCas9引導SB轉座子實現了CAR的基因組定點整合（如下圖），這是一項頗有意義的探索性研究。本人後續將有一篇文章對定點整合CAR-T研究進行回顧和總結，此處就不展開討論。
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轉座子將助力細胞療法實現point-of-care的夢想
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讓我們暢想一下未來，10年之後的細胞治療將會是什麼樣子的呢？
首先，細胞療法的價格應該足夠便宜，它不應該只是一種貴族療法；其次，細胞的製備周期要短，因為很多重症患者往往難以熬過漫長的細胞製備周期（最理想的情況也要2周以上）。據統計，參加臨床研究的受試者中，約有18.5%左右由於疾病進展而錯過了接受治療的時機。
其實在縮短回輸時間方面，人們已經進行了很多嘗試，如異體細胞治療UCAR-T可以實現現貨化生產（off-the-shelf）。而對於自體CAR-T來講，轉座子系統在縮短細胞生產時間上具有極大的優勢。傳統的病毒載體在感染T細胞之前需要預先激活（約2天時間），且病毒的多次感染、繁雜的放行檢測也耗費了大量的時間。相比之下，轉座子質粒在轉染之前無需對細胞進行激活，且轉染耗時短，放行檢測也相對簡單。
現行的CAR-T細胞生產流程中，CAR在細胞中表達之後仍然需要將細胞繼續培養一段時間（約2周左右，各家方案不同）以便獲得足夠數目的CAR-T細胞，然後才能回輸至病人體內。那麼，CAR-T細胞是否在體外擴增得越多療效就越好呢？非也。2018和2019年的兩篇文章分別對CAR-T體外培養時間對療效的影響進行了探討（如下圖所示），它們的研究結論表明，體外長時間的培養雖然能夠得到大量的細胞，但也會使T細胞逐漸分化從而使其殺傷活性降低。例如，5x105個經過3天培養的CAR-T細胞對腫瘤的殺傷能力要超過3x106個經過9天培養的CAR-T細胞。
從2017年開始，轉座子技術的領頭羊Intrexon（現更名為Precigen）和Ziopharm兩家公司的研究人員就睡美人系統對CAR-T細胞的point-of-care生產模式進行了探索，成功將自體CAR-T細胞的生產時間縮短至2天。2020年5月，巴西國家癌症研究所的研究人員亦對POC模式下的CAR-T細胞製備進行了嘗試。數據表明，在SB系統電轉T細胞後的24小時後即可將細胞回輸至體內。這些研究說明，在方便快捷的轉座子系統的幫助下，未來自體CAR-T療法很有可能擺脫漫長的製備周期，成為一種point-of-care療法。