Nature:操縱Cas9的REC3結構域可大幅降低CRISPR-Cas9的脫靶效應

2020-11-24 生物谷

圖片來自Janet Iwasa graphic for Doudna Lab。


2017年9月22日/

生物谷

BIOON/---在一項新的研究中，來自美國加州大學伯克利分校、麻省總醫院、哈佛醫學院和勞倫斯伯克利國家實驗室的研究人員鑑定出Cas9蛋白中的一個關鍵區域決定著CRISPR-Cas9如何精準地對靶DNA序列進行編輯，對它進行微調可產生超精準的基因編輯器，並且使得該基因編輯器的脫靶切割（off-target cutting）活性降低到有史以來的最低水平。相關研究結果於2017年9月20日在線發表在

Nature

期刊上，論文標題為「Enhanced proofreading governs CRISPR–Cas9 targeting accuracy」。論文通信作者為加州大學伯克利分校分子與

細胞生物學

教授、霍華德-休斯醫學研究所研究員Jennifer Doudna博士。

在CRISPR-Cas9中，Cas9蛋白起著結合和切割DNA的作用。這些研究人員說，他們鑑定出的這種蛋白區域作為DNA切割的一種主控制器發揮作用，是對Cas9進行重新設計進一步提高它的切割精準度的一種顯而易見的靶標。這種方法應當有助科學家們定製設計Cas9變異體，從而使得CRISPR-Cas9在錯誤位點上對DNA進行編輯的機率最小化。當利用CRISPR-Cas9在人體進行

基因治療

時，這是一個關鍵的考慮因素。

一種提高精準度的策略是在這種控制性的被稱作REC3的蛋白結構域中引入突變，然後觀察哪些突變會提高精準度，同時不會影響在靶切割（on-target cutting）的效率。

論文共同第一作者、Doudna實驗室研究生Janice Chen說，「我們發現即便Cas9的REC3結構域發生微小的變化也會影響在靶編輯和脫靶編輯之間的差異，這提示著這個結構域明顯是通過深入地誘發突變來改善靶向特異性的候選者。作為這項研究的延伸，相比於我們之前開展的靶向突變，我們能夠在REC3結構域中更加無偏向性地引入突發。」其他的論文共同第一作者為加州大學伯克利分校的Yavuz Dagdas和哈佛醫學院的Benjamin Kleinstiver。

超精準的Cas9

2012年，Doudna和德國馬克斯-普朗克感染生物學研究所的Emmanuelle Charpentier將Cas9蛋白改作他用，構建出一種便宜的、廉價的和易於使用的基因編輯器。從那以後，人們就已尋求降低脫靶編輯的機率。儘管改進的保真度有利於開展

基礎研究

，但是當將基因編輯用於臨床應用時，這是至關重要的，這是因為任何脫靶DNA切割可能讓關鍵基因喪失功能，從而導致永久性的和意想不到的副作用。

在過去的兩年裡，兩個研究團隊構建出高度精準的Cas9蛋白：一種特異性增強的Cas9，即eSpCas9(1.1)；一種高保真度的Cas9蛋白，即SpCas9-HF1，而且Chen和Doudna試圖了解為何它們要比如今廣泛使用的來自釀膿鏈球菌（

Streptococcus pyogenes

）的野生型Cas9蛋白更高特異性地切割。

當前，使用CRISPR-Cas9的科學家們構建出單向導RNA（sgRNA）---一種RNA分子，含有長20個核苷酸的RNA片段，而且該片段與想要靶向的長20個核苷酸的特定DNA序列互補---並且將它附著到Cas9上。這種sgRNA允許Cas9蛋白靶向互補的DNA序列，結合併切割它。但是這種Cas9-sgRNA複合物也能夠結合到不那麼精確匹配的DNA上，從而導致不想要的脫靶切割。

2015年，Doudna實驗室發現了Cas9的一種構象開關，當sgRNA與靶DNA匹配時，這種構象開關會被激活（Science, doi:10.1126/science.aac6572; Nature, doi: doi:10.1038/nature15544）。他們已發現僅當這種sgRNA與靶DNA嚴格匹配時，Cas9的三維結構，特別是它的HNH核酸酶結構域構象，會發生改變，從而激活Cas9的切割活性。然而，負責識別這種構象開關上遊的這些核酸的過程仍然是不為人知的。

在當前的這項研究中，Chen和Dagdas利用一種被稱作單分子螢光共振能量轉移（single-molecule FRET, smFRET）的技術準確地測量當Cas9-sgRNA複合物結合到靶DNA上時，這種複合物中的多種蛋白結構域，特別是REC3、REC2和HNH結構域，如何移動。

他們首先確定了eSpCas9(1.1)和SpCas9-HF1提供的特異性益處能夠根據這些Cas9變體中的HNH構象開關的激活閾值要比野生型Cas9蛋白高得多從而使得當結合到脫靶序列上時eSpCas9(1.1)和SpCas9-HF1變體更不可能激活Cas9的切割活性的事實加以解釋。

接著，他們發現REC3結構域負責檢測靶標結合的精準度，隨後這會指示REC2結構域向外旋轉而為HNH核酸酶結構域打開一條通路，從而激活Cas9的切割活性。具有這種活性構象的Cas9隨後能夠切割靶DNA的雙鏈。

Chen、Dagdas和Kleinstiver隨後證實通過讓REC3的部分片段發生突變，就有可能改變Cas9蛋白的特異性，使得HNH核酸酶結構域不會被激活，除非這種sgRNA與靶DNA非常嚴格地匹配。他們能夠設計出一種改進的超精準的Cas9（被稱作HypaCas9），這種HypaCas9保留了它的在靶切割效率，但略微更好地區分人細胞中的在靶位點和脫靶位點。

Chen說，「如果讓REC3中的某些胺基酸殘基發生突變，那麼人們就能夠調整Cas9的在靶切割活性和改進的特異性之間的平衡；我們能夠找到這樣的一個甜美的平衡點，從而確保在預定的靶標上具有足夠的切割活性，同時大幅降低脫靶事件。」

通過繼續探究Cas9的結構、功能和動力學之間的關係，Doudna和她的團隊希望能夠進一步地對這種蛋白進行高度靈敏地改造，從而利用它可靠地和高效地產生多種

遺傳

變化。（生物谷 Bioon.com）

參考資料：Janice S. Chen, Yavuz S. Dagdas, Benjamin P. Kleinstiver et al. Enhanced proofreading governs CRISPR–Cas9 targeting accuracy. Nature, Published online 20 September 2017, doi:10.1038/nature24268

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