重大突破！動植物中的線粒體基因編輯進展

線 粒 體 簡 介

線粒體（mitochondrion）是細胞中由兩層膜包被的細胞器，是細胞內物質氧化的主要場所和能量供給中心，也是細胞內自由基（ROS）產生的主要場所（美容廣告裡常說的自由基、衰老都和線粒體有莫大關係），同時調控細胞凋亡。

圖1 線粒體（此透射電子顯微鏡圖像中的藍色）是細胞製造能量的細胞器。來源：CNRI / SPL。

在人體中，線粒體內含有的環狀DNA（mtDNA）被稱為人類第25號染色體，全長16569bp，僅含37個基因、產生13種蛋白，這些蛋白質是氧化磷酸化和電子轉運鏈所必需的。線粒體是細胞核以外含有遺傳信息和表達系統的細胞器，其遺傳特點表現為非孟德爾遺傳方式，又稱核外遺傳或母系遺傳。mtDNA的突變將導致許多種代謝疾病，例如心肌病、Leber遺傳性視神經病變等，這些疾病至今無治癒方法。因此，開發針對mtDNA疾病的治療方法無疑是一項必需的工作。

表 基因變異對應的常見線粒體病種類

線粒體疾病治療之體外受精技術

圖2 華裔科學家、醫生張進摟著剛出生的三親嬰兒，嬰兒出生於2016年4月。

2016年，世界上首位「三親嬰兒」誕生 (Reardon 2017)。「三親嬰兒」攜帶三個人的遺傳物質，其核基因組一半來自父親，一半來自母親，其線粒體由一位健康女性捐贈者提供。原母親四分之一的線粒體攜帶亞急性壞死性腦病基因，曾經4次流產，之前生下的兩個小孩也因這種遺傳疾病分別於6歲和8月齡時死亡，為了幫助這名女性，張進帶領其團隊採用了「三親嬰兒」技術。

圖3 「三親嬰兒」技術原理。主要包括以下三步驟：（1）取出原母親和捐贈母親的卵子來接受原父親精子的分別受精，製造出含不同卵子的2個受精卵；（2）取出2個受精卵中帶有遺傳信息的細胞核；（3）將原母親受精卵中的細胞核移植到捐贈母親不含細胞核的受精卵中，最終移植到母體子宮內 (Wolf et al. 2015) (Kang et al. 2016)。

這一消息引起了巨大爭議。一些專家認為這開啟了生殖醫學的新時代，另一些專家懷疑手術的目的，並認為必須加強對相關技術的監督。

線粒體疾病治療之基因編輯

圖4 線粒體基因編輯。來源：ANGELA GAO。

01CRISPR系統與線粒體有緣無分

基因編輯工具箱內的明星成員——CRISPR-Cas9編輯系統對mtDNA無效，因為該系統使用RNA將Cas9酶引導至靶標，但RNA無法穿過被膜包圍的線粒體 (Gammage et al. 2018a)。

圖5 通過透射電子顯微鏡觀察到的線粒體，其膜（粉紅色）阻止了CRISPR–Cas9編輯系統的進入。來源：CNRI / SPL。

02ZFN、TALEN系統與線粒體一見鍾情

沒想到基因編輯工具箱內的老成員——鋅指核酸酶（ZFN）系統 (Urnov et al. 2005; Gammage et al. 2018b)、轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALEN）系統 (Hashimoto et al. 2015) (Bacman et al. 2018)在線粒體基因編輯中被證明是有效的。這些系統中消除mtDNA上的突變是將攜帶突變的mtDNA直接降解，mtDNA拷貝數的降低在實際疾病治療中可能會帶來更多的風險。同時，這些系統中的蛋白對鹼基的特異性結合通常長達幾十個鹼基對（bp），還不能達到精準的單鹼基編輯要求。

圖6 mitoTALEN的單體結構及針對兩種疾病設計的TALE代碼 (Hashimoto et al. 2015)。

03DdCBE系統與線粒體天作之合

近期，《Nature》雜誌報導了被命名為DdCBE的mtDNA編輯系統，通訊作者為華盛頓大學的Joseph Mougous教授與Broad研究所的劉如謙（David Liu）教授，這是第一款實現mtDNA精確編輯的分子工具 (Mok et al. 2020)，其重要組成是一個名為DddA的細菌毒素。DddA是一種胞苷脫氨酶，可催化胞嘧啶（C）轉化為尿嘧啶（U），與其他胞苷脫氨酶明顯不同的是，DddA靶向雙鏈DNA（dsDNA）而非單鏈DNA（ssDNA）或RNA，且不需要解旋。

圖7 DddA的三維結構，DddAtox部分（紫色）和DddIA部分（灰色）(Mok et al. 2020)。

從DddA蛋白到DdCBE編輯系統

還需要解決幾個問題：

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胞苷脫氨酶對哺乳動物細胞有毒，因為它會突變遇到的每一個胞嘧啶（C），如何解決這個問題？

研究者將DddA蛋白中的DddAtox結構域拆為DddAtox-N和DddAtox-C兩個部分（文中也稱為split-DddAtox），只有它們到達編輯位點相遇後才會恢復脫氨酶的功能。

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如何進入線粒體呢？

構建載體時加上線粒體導肽（MTS）基因即可。

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split-DddAtox如何靶向特異性鹼基呢？

研究者將split-DddAtox與TALE蛋白結合，又用上了前述的基因編輯工具箱內的老成員，TALE蛋白能識別特異的DNA序列，在MTS的幫助下，它可以進入線粒體，並結合在特定的mtDNA序列上。

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胞苷脫氨酶將胞嘧啶（C）轉化為尿嘧啶（U）而不是DNA特異性鹼基胸腺嘧啶（T），但尿嘧啶（U）會在尿嘧啶-DNA糖基化酶的幫助下從DNA上被切下並用胞嘧啶（C）取代，瞧見沒，鬧了一圈又回到了原點，如何避免呢？

將split-DddAtox部分與尿嘧啶糖苷酶抑制劑（UGI）相連，這樣就可以保護尿嘧啶（U）免受糖基化酶的作用，在下一輪的DNA複製或修復時，其互補鏈上的鳥嘌呤（G）就會被腺嘌呤（A）取代，最終把鹼基對C•G轉變為鹼基對T•A。

圖8 DdCBE編輯系統的結構MTS-mitoTALE-split-DddAtox-UGI。（a）及編輯原理（b）。來源：《Nature》雜誌。

至此，DdCBE編輯系統才算完整。

編輯效率及影響因素：研究者在人類細胞中測試了5個基因，編輯效率4.6%-49%，影響因素包括兩個split-DddAtox的方向、TALE蛋白設計、兩個亞基之間的間隔、靶點、TALE的相對結合位置等。

對脫靶的研究：在核基因組中沒有脫靶作用，在mtDNA中的脫靶效率很低。DdCBE的編輯活性能夠持續18天，其間對mtDNA的編輯沒有降低細胞存活率，沒有產生大的mtDNA片段缺失，也沒有影響mtDNA拷貝數。

限制：DdCBE系統只能有效的編輯基因組中緊挨T的C鹼基，有很大的限制性；目前只能使mtDNA中積累的突變鹼基減少，卻不能完全消除，但由於線粒體疾病的特殊性，減少突變位點也是能夠起到治療作用的。

儘管距離醫學應用還很遙遠，但通過該技術可開發動物疾病模型，用以研究線粒體突變疾病，確認突變對疾病的影響，並針對相應通路篩選出藥物。這也只是個開始，未來一定還會出現更多的mtDNA精準編輯系統。另外，不放上MTS導肽，這套編輯系統用於細胞核基因編輯也是妥妥的呀...

在 植 物 中 的 進 展

1970年11月，袁隆平團隊成員李必湖在海南省三亞市南紅農場的水溝邊發現了1株花粉敗育的野生稻（簡稱「野敗」），為雄性不育系的選育打開了突破口。20世紀70年代培育成功的三系雜交水稻是水稻科技革命的一次重大飛躍，配製一個優良雜交種需要特定的三個系，包括不育系、保持系和恢復系。所用的不育係為細胞質雄性不育（cytoplasmic male sterility，簡稱CMS），表現為花粉敗育，與恢復系雜交來繁育雜交後代。一般認為CMS與線粒體基因有關，但限於分子生物學技術，一直沒有報導過直接敲除線粒體內的有關基因能否如期望般恢復育性。

去年，日本的兩個團隊合作，利用線粒體TALENs技術（mitoTALENs）敲除了水稻品種BTA線粒體中的orf79基因和甘藍型油菜品種SW18線粒體中的orf125基因 (Kazama et al. 2019)。

圖9 敲除水稻品種BTA線粒體中的orf79基因恢復了育性

(Kazama et al. 2019)。

圖10 甘藍型油菜品種SW18線粒體中的orf125基因恢復了育性 (Kazama et al. 2019)。

說到這裡，你可能會覺得這項技術並沒有太大的突破，但是請再回憶一下兩系法雜交水稻的原理。1973年，石明松在沙湖原種場「農墾58」大田中，發現「光敏感核不育水稻」農墾58S，這項成果是我國水稻史上繼矮化育種、雜交三系成功後的第三次重大發現，這種方法只有不育系、恢復系，而不需要保持系。pms3 核基因編碼一個長度為1236bp的長鏈非編碼RNA，其正常轉錄是長日照條件下維持花粉發育所必需的，但由於農墾58S中1個鹼基的突變導致其轉錄量降低，從而造成農墾58S在長日照條件下花葯的程序化死亡。而短日照條件下，這段非編碼RNA並不是維持花粉必需的，所以農墾58S在短日照條件下正常可育。這就是一系兩育。但其最大缺點是制種受到時空條件的限制。

不考慮政策原因，只從科學理論上，大家可以琢磨一下，如果使用可誘導的線粒體基因編輯系統，是不是可以創造出另一種兩系法雜交水稻呢？小編覺得，這項研究不僅在功能基因研究方面給了廣大研究者更多的技術支持，更可能在今後的育種方面創造更大的精彩！

Reference

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Gammage PA, Viscomi C, Simard ML, Costa ASH, Gaude E, Powell CA, Van Haute L, McCann BJ, Rebelo-Guiomar P, Cerutti R, Zhang L, Rebar EJ, Zeviani M, Frezza C, Stewart JB, Minczuk M (2018b) Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo. Nat Med 24 (11):1691-1695. doi:10.1038/s41591-018-0165-9

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Kang E, Wu J, Gutierrez NM, Koski A, Tippner-Hedges R, Agaronyan K, Platero-Luengo A, Martinez-Redondo P, Ma H, Lee Y, Hayama T, Van Dyken C, Wang X, Luo S, Ahmed R, Li Y, Ji D, Kayali R, Cinnioglu C, Olson S, Jensen J, Battaglia D, Lee D, Wu D, Huang T, Wolf DP, Temiakov D, Belmonte JC, Amato P, Mitalipov S (2016) Mitochondrial replacement in human oocytes carrying pathogenic mitochondrial DNA mutations. Nature 540 (7632):270-275. doi:10.1038/nature20592

Kazama T, Okuno M, Watari Y, Yanase S, Koizuka C, Tsuruta Y, Sugaya H, Toyoda A, Itoh T, Tsutsumi N, Toriyama K, Koizuka N, Arimura SI (2019) Curing cytoplasmic male sterility via TALEN-mediated mitochondrial genome editing. Nat Plants 5 (7):722-730. doi:10.1038/s41477-019-0459-z

Mok BY, de Moraes MH, Zeng J, Bosch DE, Kotrys AV, Raguram A, Hsu F, Radey MC, Peterson SB, Mootha VK, Mougous JD, Liu DR (2020) A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature. doi:10.1038/s415

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