自最早的基因編輯工具問世至今，基因編輯技術已經有近 30 年的歷史了。特別是 2012 年以來，隨著 CRISPR 的橫空出世，基因編輯技術日漸趨於成熟。然而遺憾的是，相對於基因編輯工具本身的快速進化，其遞送技術的發展極其緩慢和困難。而遞送之於基因編輯治療的重要性如同火箭之於登月。由於遞送技術的滯後發展，體內基因編輯治療的臨床應用困難重重，整個領域都在期待遞送技術的突破。
諾獎得主 Jennifer Doudna 在 2020 年初給Nature雜誌撰寫的綜述中，系統論述了基因編輯治療的前景和挑戰。在展望 CRISPR 美好應用前景的同時，這位今年的諾獎得主發出了「遞送可能仍然是基因編輯體細胞治療的最大瓶頸」的感嘆（Delivery remains perhaps the biggest bottleneck to somatic-cell genome editing）。
近幾年來，基因編輯工具本身的發展令人眼花繚亂，各種 Cas9 變體、鹼基編輯工具及其變體、Prime Editor 等，層出不窮。但是，這些工具的臨床應用必須回歸到遞送，而迄今為止可選的遞送工具還是有幾十年歷史的『「老三件」：AAV、慢病毒以及納米材料。儘管這些遞送載體廣泛用於基礎研究，但它們卻不太適合直接用於臨床。基因編輯的臨床應用有著安全性和有效性的雙重標準。一方面，病毒載體由於長時間的表達基因編輯酶，會帶來安全性上的不確定性；另一方面，納米材料則面臨效率上的挑戰。2020 年上半年，張峰作為創始人的著名基因編輯治療科技型企業 Editas 實施了首例人體基因編輯治療的臨床研究 (Nature Biotechnology volume 38, page 382 (2020))。但由於該研究使用 AAV 作為載體，CRISPR 將長期與患者共存，具有一定的風險。理想的基因編輯遞送工具需要兼具瞬時和高效的特點，以確保治療的安全性和有效性。
近日，上海交通大學系統生物醫學研究院的蔡宇伽團隊在《自然 - 生物醫學工程》（Nature Biomedical Engineering）雜誌上發表了一篇題為：Lentiviral delivery of co-packaged Cas9 mRNA and a Vegfa-targeting guide RNA prevents wet age-related macular degeneration in mice的研究論文，發明了一種介於病毒載體與非病毒載體之間的類病毒體（virus-like particle, VLP）遞送技術。VLP 可以遞送 CRISPR/Cas9 mRNA, 實現安全和高效的體內基因編輯。值得一提的是，該技術是我國首個完全自主開發的原創型基因治療載體，體現了我國在基因治療領域的科技進步。
「實現基因編輯酶在體內的瞬時遞送是我們基因治療科學家的終極夢想。有了這樣的載體，我們可以最大限度地提高基因編輯治療的安全性，也意味著基因編輯體內治療離臨床應用無限接近。然而，實現這個夢想並不容易，也幾乎沒有人相信可以成功。我從博士生時代開始嘗試， 到現在成為博士生的導師，經過 10 年時間的不斷地探索與積累，直到最近才取得了核心突破。」蔡宇伽博士說。
慢病毒載體可以高效感染幾乎所有的細胞，而非病毒成分 mRNA 具有瞬時性的特點。蔡宇伽團隊利用 mRNA 莖環結構與噬菌體衣殼蛋白特異識別的原理，通過病毒工程技術，將兩者的優點完美的結合起來，創造了新型遞送技術 VLP-mRNA。通過 VLP-mRNA 遞送 Cas9 mRNA, Cas9 的存在時間只有 72 小時。研究發現，與長時間表達 Cas9 的病毒系統相比，VLP-mRNA 可以顯著降低、甚至完全避免脫靶效應。另外，VLP-mRNA 可以遞送整個 CRISPR 元件（Cas9 與 gRNA）, 克服了 AAV 載體運載能力小的限制，甚至可以遞送更大的鹼基編輯工具。
研究人員還將 VLP-mRNA 技術用於眼科疾病的治療。老年性黃斑變性（AMD）是一種退行性眼底疾病。患者表現為中心視力下降、視物變形、周邊部或中心視野出現暗點，對老年人的生活質量造成極大的影響。據統計，西方發達國家中 70 歲以上的老年人罹患 AMD 者超過 40%。隨著我國老年人口日漸增多，黃斑變性的發病率也越來越高。另外，糖尿病患者也可能罹糖尿病相關黃斑變性，總體發病率在 10% 左右。目前，黃斑變性的治療方法是 VEGF 單克隆抗體。然而，抗體需要反覆給藥；另外，抗體外溢可導致嚴重的副反應。
研究團隊利用雷射誘導的小鼠黃斑變性模型，通過視網膜下腔注射的方式，發現 CRISPR 特異性的分布在視網膜色素上皮細胞（RPE），而 RPE 細胞是眼內 VEGF 的主要來源。VLP 遞送 CRISPR 實現了高達 44% 的 vegfa 基因敲除，降低了 63% 的新生血管面積。第二代測序表明 VLP-mRNA 未誘導出脫靶效應。對於此前報導的 AAV 遞送 CRISPR 引起的大片段缺失，研究團隊通過第三代測序，僅能發現勉強高於背景的信號。值得一提的是，VLP mRNA 無論在體外還是在眼內，均未引起免疫反應。這些實驗結果有力支持了 CRISPR 在黃斑變性基因治療上的臨床應用潛力。
總結
總的來說，VLP-mRNA 是一種通用型的、瞬時性的 CRISPR 遞送工具，兼具高效和安全的優點。該技術無疑將幫助 CRISPR 體內基因編輯治療時代的真正來臨，為無藥可治或有藥難治的遺傳性、獲得性以及感染性疾病的患者帶來新的希望。
上海交通大學博士生凌思凱是本文的第一作者，上海交通大學附屬第一人民醫院眼科臨床醫學中心的楊仕琪博士、孫曉東教授也為本研究的完成做出了重要貢獻。復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院、瑞金醫院、中科院、丹麥奧胡斯大學的科學家參與了本研究。
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