作者：塵
RAS癌基因突變是人類癌症中最常見的激活突變，發生在30%的人類腫瘤中。儘管是最早發現的癌基因之一，但三十年的努力一直未能識別出臨床上可行的KRAS蛋白抑制劑，主要有兩個原因：(1)KRAS以皮摩爾親和力與GDP和GTP結合，嚴重阻礙了開發核苷酸競爭抑制劑的努力；(2)KRAS蛋白缺乏其它深表面疏水口袋，阻礙了尋找高親和力變構抑制劑的努力[1][2][3]。
事情在2013年出現了重大突破，Shokat等[4]報告了一種旨在克服這些挑戰的新策略，該策略使用共價抑制劑來靶向KRASG12C的活性半胱氨酸。野生KRAS與GDP結合的晶體結構圖如下圖3左圖所示[5]。結晶學研究表明，在效應因子結合的Switch-II區域的下面形成了一個新的口袋，值得注意的是，突變體cys12位於與效應因子相互作用有關的核苷酸口袋和切換區附近（如下圖1右圖所示），基於二硫化物的片段篩選法在GDP結合狀態下利用完整蛋白質質譜法對有480個系鏈化合物的文庫進行了篩選，得到了片段6H05和2E07，且兩個片段化合物未檢測到與含有3個天然半胱氨酸殘基的野生型K-RAS的反應。
圖1. 野生型KRAS(左)與KRASG12C(右)GDP結合示意圖
選取最優片段6H05進行構效關係研究，得到了最高活性化學物(6)，結合模式如右圖所示（如下圖2左所示），化合物6不結合在核苷酸口袋中，而是從Cys12延伸到主要由Switch-II組成的相鄰口袋中。這種完全形成的口袋在RAS的其他已發表的結構中並不明顯，儘管在某些情況下可以看到凹槽，以前的研究表明這個區域存在變構位點。將複合結合區稱為Switch-II口袋(S-IIP) [4]。
圖2. 構效關係研究圖(左)；化合物6(青色)與GDP(灰色)以及Ca2+(綠色)結合的共晶結構示意圖 (右)
S-IIP位於RAS的中心β-摺疊與α2-(Switch-II)和α3-螺旋之間，明確的電子密度顯示了化合物6在S-IIP內部的位置，並證實了6與Cys12之間的二硫鍵（如下圖3左所示）。6的疏水二氯苯基形成幾個疏水接觸。Glu99和Gly60形成直接氫鍵至6（如下圖3右所示）。而Switch-II對形成S-IIP有明顯的重排作用，Switch-I的構象沒有從GDP結合狀態改變[4]。
圖3. 化合物6電子云密度圖(左)；S-IIP的表面表示在化合物左右，顯示氫鍵(黃線)。指示殘基與6發生疏水接觸(右)
Shokat等沒有繼續使用基於二硫化物的化合物，而是轉向了碳基親電劑、丙烯醯胺和乙烯基磺醯胺，得到了高效的丙烯醯胺類化合物，其中化合物12活性很好，如下圖6所示。同時又證明了化合物12不和野生型KRAS的半胱氨酸反應。覆蓋多個共晶結構表明，化合物通過口袋遵循類似的軌跡，並將官能團投射到(o-)和(p-)子口袋中。儘管末端苯環上有相當大的差異，但這些化合物滿足相似的疏水相互作用，支持S-IIP的這一區域的關鍵作用(如下圖4所示) [4]。
圖4. 10 mM的化合物24小時後的加合物形成(左)；用GDP結合的K-Ras(G12C)覆蓋8，9和11的共晶結構(右)
EDTA對核苷酸交換的催化作用表明，雖然化合物可能會微妙地影響金屬結合，導致核苷酸親和力的變化，但即使在S-IIP被佔據的情況下，Mg2+也不能被排除。結構分析還預測，交換因子SOS的功能可能會受到與S-IIP結合的影響。用化合物8或12阻斷SOS催化的核苷酸交換處理K-RAS(G12C)，如上所述，這些化合物不會損害EDTA催化的GDP交換，具體結果如下圖5所示[4]。
圖5. SOS催化的全長K-RAS(G12C)的核苷酸交換單獨(a)，或用8(b)或12(c)標記的KRASG12C；(a)a-c.e的圖式表示；(e)a-c圖的半衰期
接著用免疫共沉澱法發現了化合物12將破壞RAS的GTP狀態的構象，並損害與效應因子(如Raf)的相互作用。在一小部分基因表型的肺癌細胞系中研究了化合物12的作用。如預期的那樣，與沒有G12C突變的組(H1437、H1299和A549)相比，含有G12C突變的細胞系(H1792、H358、H23和CALU-1)在處理後顯示出存活率降低和凋亡增加，如下圖6(左)圖所示。高敏感的H1792細胞顯示低水平的K-RASGTP，與抑制劑與K-RAS GDP的優先結合一致，如下圖6(中)圖所示。它們是高度依賴K-RAS的如下圖6(右)圖所示。值得注意的是，缺乏G12C的K-RAS依賴性(A549)和非依賴性(H1299)細胞株對化合物12不敏感。化合物12在H1792細胞中的半數有效濃度(EC50)為0.32±0.01 μM[4]。
圖6. 肺癌細胞對抑制劑的敏感性、K-RasGTP水平及對K-Ras的依賴性。相對於DMSO治療72h後的存活率百分比(左)；穀胱甘肽S-轉移酶(GST)標記的RBD(C-Raf的RAS結合域)與裂解液孵育測定K-RAS GTP水平(中)；轉染KRAS siRNA 72h後評價細胞存活率(右)
總體而言，細胞數據為S-IIP結合複合物在K-RASG12C驅動的癌症中的基因型特異性使用提供了概念驗證。
Matthew P. Patricelli等[6]在化合物12的基礎上繼續探索，發現化合物12在含有KRASG12C突變的NCI-H358(H358)細胞中沒有表現出實質性的KRASG12C共結合，即使在100 μmol/L化合物處理6小時後也沒有表現出明顯的KRAS 共結合。為了解決化合物12缺乏細胞活性的可能原因，需要更有效的Switch II口袋抑制劑，進行了基於迭代結構的共價KRASG12C靶向試劑的設計，並測試了它們對純化的重組KRASG12C的活性以及它們在細胞中結合KRAS G12C的能力。ARS-853，給出了很大的希望，如下圖7所示。
圖7. 化合物12的構效改進
在生化測定中，ARS-853與KRASG12C的結合速率常數為76M-1s-1，比化合物12提高了600多倍，細胞結合IC50在6小時為1.6 μmol/L。在GDP存在下，配體結合的KRASG12C的高分辨晶體結構將ARS-853的結合位點確定為前面描述的開關II口袋。在該結構中，ARS853共價連接到C12上，並延伸到位於KRAS的中心β-摺疊與α2和α3螺旋之間的Switch II口袋區域。相對於其他已發表的開關II結合化合物的結構，ARS853誘導α2螺旋的旋轉，伴隨著M72的位移，以適應不同疏水口袋中的配體。這個疏水口袋被ARS-853的芳環佔據，氯和甲基環丙基取代基提供了緊密的範德華接觸，而酚羥基與D69形成了氫鍵。ARS-853丙烯醯胺的羰基與保守的K16和一個與通常的鎂離子配位的水分子形成氫鍵，同時佔據與KRAS的GTP結合形式的末端磷酸相似的位置。總體而言，該結構的多個特徵表明，ARS-853結合的KRASG12C代表KRAS的非活性狀態。具體如下圖8所示[6]。
圖8. H358細胞處理6h後胰蛋白酶消化的KRASG12C信號強度和LC/MS-MS分析(左)；與KRASG12C結合的ARS-853的晶體結構突出了開關II口袋中的關鍵氫鍵和疏水相互作用(右)
Matthew R. Janes等[6]進一步通過實驗說明了ARS-853抑制KRASG12C癌蛋白在細胞內的功能，ARS-853細胞參與需要KRAS G12C癌蛋白上的核苷酸快速循環，KRAS G12C GTP水平受上遊信號因子調控。
儘管獲得了以上的突破，揭示以前未知的RAS結合口袋，研究者們也開展了大量的篩選試驗，但它們只導致了有限的證明，同時都嚴重缺乏對靶向作用機制的令人信服的體內反應的證明[7][8]。Matthew R. Janes等[9]基於結構的藥物設計，繼續提高突變導向和KRAS特異性抑制劑的效力和類藥物特性。研究發現ARS-853系列化合物的主要缺點是血漿代謝穩定性短(t1/2<20min)和小鼠口服生物利用度差(F<2%)，使其不能用於進一步的體內研究。有限的結構活性關係也限制了ARS-853系列的進一步效力改進。將重點轉移到設計結構上不同的支架上，這些支架適當地定位丙烯醯胺的構象和軌跡，並允許最佳的疏水結合部分在S-IIP中的適當放置。我們假設ARS-853系列的柔性2-氨基-1-(π-哌嗪-1-基)乙烷-1-酮連接子可以縮短並被更剛性的雙環支架取代，並適合由之前報導的ARS-853共晶結構重新封裝的S-II和A3螺旋之間的空閒區域[6]。經過廣泛的支架優化，我們確定喹唑啉核心是一種多功能支架，可以克服ARS-853的SAR限制，並具有更好的類藥物特性。如下圖9所示。
圖9. ARS-853的支架結構優化研究
這一進展導致了基於喹唑啉的系列，並在對支架周圍的取代基進行系統優化之後，導致具有良好ADME/PK以及KRAS共價結合活性的顯著改善，如下圖10所示[9]。
圖10. G12C-TE與喹唑啉核7位和8位取代基相關的生化速率常數的構效研究
繼續合成了幾個喹唑啉系列活性較高的化合物，最引人關注的是化合物ARS-1620，它含有一個氟苯酚疏水結合部分，具有軸向手性，表現了S-阿託品對KRAS-12半胱氨酸的異構體反應性(如下圖11所示) [9]。
圖11. ARS-1620化學結構
ARS-1620與KRASG12C結合的共晶結構顯示了從最初的S-IIP KRASG12C抑制劑到Cys-12的獨特結合模式和結合軌跡，並揭示了與His-95額外的關鍵相互作用的獲得，從而獲得了比ARS-853系列化合物更剛性、更有利的共價反應構象(如下圖12、13所示) [9]。
圖12. ARS-1620(黃金)和GDP結合的KRASG12C共晶結構，位置為開關1(藍色)、開關2(粉色)和誘導開關2口袋(S-IIP)區域；從共晶結構看ARS-1620與KRASG12C的結合方式(右)；
圖13. ARS-1620(金色)和ARS-853(綠色)的結合模式和關鍵相互作用的比較
在生化實驗中，ARS-1620共價修飾KRASG12C的觀察速率比ARS-853提高了10倍，證明了ARS-1620對KRAS的修飾效力比以前的化合物有了明顯的提高。ARS-1620優先與KRASG12C的GDP結合狀態作用，缺乏對野生型(WT)-KRAS蛋白的任何殘基的可檢測到的反應性。此外，與ARS-1620共價結合的KRAS G12C缺乏SOS和EDTA介導的核苷酸交換能力。同時在細胞層面證實了ARS-1620的抑制活性，Pan-RAS中對KRASG12C的選擇性[9]。
共價抑制劑的一個主要風險是可能與非靶蛋白發生非特異性反應。ATP口袋附近有200個帶有反應性半胱氨酸的激酶[10]，同樣地延伸到含有反應性半胱氨酸的非激酶蛋白[11]，如果被靶向，可能會產生不必要的特異性毒性。為了更好地定義ARS-1620可能的脫靶易感性和特異性，使用無偏見的化學蛋白質組篩選來評估細胞內的共價反應活性，解析度覆蓋3012個注釋蛋白質的8501個半胱氨酸殘基，最終證實了ARS-1620 靶點專一性[9]。
ARS-1620在小鼠體內表現出極好的口服生物利用度和足夠的血液穩定性，如下圖14(左)所示，使得可以定量測量體內G12C靶點佔有率。目前仍不清楚ARS-1620是否能夠滿足足夠的共價動力學和藥代動力學特性，以使S-IIP G12C靶向方法在體內成功。為了說明ARS-1620是否具有體內靶點佔有率的能力，在已建立的攜帶KRAS p.G12C的異種皮下移植模型中口服了ARS-1620。在單次口服劑量或連續5次每日劑量後，ARS-1620產生的平均腫瘤峰值濃度分別為1.5 μM (50 mg/kg)和6.5 μM(200 mg/kg)，這使得KRAS G12C靶點佔據顯著(≥70% G12C-TE在200 mg/kg)超過24小時，如下圖14(右)所示。在這些暴露下，ARS-1620提供了顯著的G12C目標佔有率(75%至90%G12C-TE)以及RAS-GTP和下遊信號抑制[9]。
圖14. ARS-1620的生化、細胞G12C-TE和藥物性質綜述(左)；MIA-PaCa2異種移植瘤單次(qd*1)或連續5天(每天qd*5)口服G12C-TE和ARS-1620(μM)暴露的藥效學(PD)/PK評估(每組4例)
接下來，通過動物模型試驗證明了目標佔有率能轉化為體內的抗腫瘤活性。如下圖15所示[9]。
圖15. ARS-1620或R-ATRO-異構體在MIA-PaCa2(p.G12C)或H441(p.G12V)皮下移植瘤(每組8隻小鼠)中的抗腫瘤作用(左)；G12C-TE及每日治療3周對腫瘤RAS活性的影響(右)
對KRAS依賴性的系統評估揭示了體外和體內腫瘤模型對KRAS抑制的不同敏感性，也體現了3D-橢球體系統能很好的預測體內抗腫瘤反應活性。如下圖16所示[9]。
圖16. KRAS依賴性的體外和體內腫瘤模型系統評估
最後在在PDX腫瘤模型中證明了ARS-1620有效和選擇性的抗腫瘤活性，如下圖17、18所示。值得注意的是PDX1868含有EGFR T790M、L858R驅動突變，PDX0170在PMS2，MSH2，MSH6和APC中存在Lynch症候群突變。在所有採用的腫瘤模型中，ARS-1620在整個3周的治療期間耐受性良好。此外，在CD-1小鼠身上沒有觀察到ARS-1620的臨床症狀或毒性，即使在7天內每天口服劑量高達1000毫克/公斤。在400 mg/kg以上，ARS-1620抑制了PK飽和度，因此在細胞系和PDX來源的模型中沒有進一步增強抗腫瘤效果[9]。
圖17. 攜帶KRAS p.G12C(n=4)，p.G12D(n=1，PDX1168)或WT等位基因的已建立的患者源性腫瘤移植(PDX)治療3周後腫瘤體積的百分比變化
圖18. 對具有代表性的pG12C PDX腫瘤在治療3周後(最後一次給藥後1小時)對p-ERK、p-S6和p-AKT進行IHC評估
總體而言，ARS-1620作為單一藥物在NSCLC模型中廣泛有效的體內證據提供了概念證明，即相當大一部分p.G12C KRAS突變的患者可能受益於KRAS G12C導向的治療。Matthew R. Janes等對於ARS-1620研究提供了第一個體內證據，證明S-IIP靶向治療方法可能是治療KRAS p.G12C突變癌症患者的一種有前途的治療策略。
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