文 | 墨海塵心
經過大量的優化工作，Shokat小組確定的早期HITS被MatthewR. Janes等修改，以提供一種適合體內應用的化合物，ARS-1620。早在Shokat實驗室最初披露研究成果之前，Amgen公司已經開始確定KRAS G12C的共價抑制劑的研究，利用Carmot的技術平臺得到了化合物1，如下圖1所示[1][2][3][4]。
化合物1與GDP-KRAS G12C的共結晶揭示了化合物1相對於ARS-1620採用了一種新的結合模式，1的四氫異喹啉環佔據了KRAS表面先前未被開發的隱袋，該口袋由組氨酸-95側鏈的旋轉揭開，並包含部分H95、Y96和Q99。如下圖1所示儘管與ARS-1620相比，這個隱蔽口袋的接合導致細胞效力提高了數倍，但化合物1在齧齒動物模型系統中存在非常高的清除率和低的口服生物利用度，使其不適合在體內使用。尋求利用H95/Y96/Q99隱蔽口袋的替代方法，這種口袋可能會提供具有更好藥用性能的線索[4]。
圖1. ARS-1620(藍色)與化合物1 (粉紅色)的GDP-KRASG12C結合模式的比較
同時ARS-1620雖然該加合物在體外和體內對KRAS G12C突變的腫瘤顯示出良好的抗增殖活性，但為了得到治療上有用的分子，細胞效力的進一步提高似乎是必要的。
化合物1和ARS-1620的結合模式的疊加表明，取代ARS-1620的喹唑啉酮氮(N1)可能提供一種進入H95隱袋的替代手段，從而產生新的、增強效力的KRAS G12C抑制劑[4]。
圖2. 化合物1和ARS-1620的結合模式的疊加概念圖
製備了一系列酞嗪類似物來驗證假設，其中酞嗪核心(X=N，Y=C)的C4位置(Y)被一系列芳基取代。測量了SOS1催化的GDP/GTP交換的抑制程度和下遊ERK磷酸化信號的降低程度。研究發現C4(2)的苯基取代導致的效價比ARS-1620低約10倍(IC50=20.1 µM)，在p-ERK細胞實驗中，效價比ARS-1620低20倍(IC50=58 µM)，如下圖3所示[4]。
圖3. 被設計接觸隱袋的雜化支鏈化合物的生化和細胞活性
化合物2與GDP-KRAS G12C的共結晶證實了化合物2採用了類似於ARS-1620的結合模式，但新引入的C4苯基取代基佔據了設計的H95/Y96/Q99隱袋，如下圖4a所示。然而，C4苯基未能與隱袋殘基(例如Y96)進行許多非共價接觸，這促使研究進一步的苯環取代是否會與隱袋殘基產生額外的接觸，從而提高效力。在2的苯環上添加了一系列越來越大的鄰位取代基(見上圖化合物3-8)。化合物8被證明是最優的，然而，它顯示了與ARS-1620相當的生化和細胞IC50值。為了進一步提高效力，還嘗試了改變化合物8的酞嗪核心的效果。值得注意的是，與8相比，喹唑啉酮9在生化和細胞效力方面有顯著的改善，所得到的化合物在體外試驗中的效力是ARS-1620的~3-9倍。化合物9與GDP-KRAS G12C的共結晶證實了9採用了異丙基苯基與隱袋的Y96、H95和Q99殘基緊密接觸的結合模式，以及異丙基苯環和酞嗪環幾乎正交取向的結合模式，如下圖4b所示[4]。
圖4.化合物2和9KRAS G12C的X射線晶體學研究
同時通過手性色譜分離R-和S-阿託品證實(R)-9的效力明顯高於相應的(S)-9阿託品，如下圖5所示。雖然(R)-9被證明是KRAS G12C信號的一種特別有效的抑制劑(p-ERKIC50=0.130 µM)，但GDP-KRAS G12C共晶結構提出了幾個進一步優化的前景：(1)哌嗪C2位的取代似乎提供了通過與C12、E62和Y96更多接觸來增強活性的機會，以及(2) (R)-9的氟酚「尾」的取代似乎提供了與親脂殘基形成更廣泛接觸的機會。此外，儘管(R)-9的藥效前景看好，但PK研究顯示在BALB/c小鼠中沒有可測量的口服生物利用度。較低的膜通透性和相對較差的水溶性被認為是可能的致病因素。因此，C2和C7修飾也被視為調節(R)-9的生物藥學特性以提高未來類似物生物利用度的潛在機會，如下圖5所示[4]。
圖5.優化(R)-9的哌嗪取代基(R2)和親脂性「尾部」(R1)區域提高效力和生物利用度
對(R)-9進行修飾，用更大的基團取代了它的C7氟酚部分，這些基團旨在與「尾部」子袋中的殘基進行額外的接觸。在繼續使用ERK磷酸化實驗作為主要篩選的同時，也使用KRAS p.G12C(MIA Paca-2)和KRAS p.G12S(A549)細胞篩選以確認生長抑制活性僅針對p.G12C突變的細胞。萘酚(10)和吲唑(11)取代物確實在ERK磷酸化和活性測定中顯示出增強的活性，但是這些類似物繼續顯示出較差的水溶性、低的MDCK滲透性，如上圖5所示[4]。
為了提高MDCK的通透性，研究了去掉(R)-9中的酚類部分得到氟苯基(12)的效果發現這種修飾在p-ERK和活性測定中都沒有活性損失，而MDCK通透性增加了3倍多。在引入哌嗪C2-甲基取代基的相關類似物中也保留了良好的MDCK滲透性，甲基哌嗪(13)不僅進一步改善了細胞活性(p-ERKIC50=47 nM)，而且還顯示了可測量的小鼠口服生物利用度(12%)。用更大的親脂取代基(例如鄰氯苯基(14)或鄰三氟苯基(15))取代13的氟苯基尾部的嘗試導致細胞活性和MDCK通透性降低。同樣，雖然在13中重新引入酚類部分(以提供氟苯酚(16))對細胞活性的影響很小，但膜的通透性顯著降低[4]。
由於(R)-9和(R)-16的酚性官能團成為這些類似物降低MDCK滲透性的關鍵因素，研究一種替代策略來減輕這種不利影響。假設膜擴散過程中苯酚的去溶劑化增加了膜滲透的能量成本，研究喹唑啉酮環C8位的氮摻雜是否可以通過提供一個內部氫鍵受體來滿足膜滲透過程中相鄰的酚類供體，從而提高MDCK的滲透性。結果氮喹唑啉酮(17)和(18)與它們的非氮雜同系物(9和16)相比，不僅表現出顯著的MDCK通透性，而且還顯著改善了水的溶解性。化合物17的口服生物利用度仍令人失望(1.3%)，而氮喹唑啉酮18的口服生物利用度顯著提高(33%)，細胞活性顯著增強(p-ERK IC50=44 nM；MIA Paca-2活性IC50=5 nM)。綜合考慮MDCK的滲透性、生物利用度、體內清除率、效力、代謝穩定性、水的溶解性決定對18進行進一步優化[4]。
隨後的研究發現化合物18的一個新挑戰，雖然異丙基苯基-喹唑啉酮聯芳鍵鍵的空間擁擠環境極大地限制了旋轉，導致了可分離的阿託異構體的產生，但它並沒有完全限制圍繞這個鍵的旋轉。異構體在25°C下發生緩慢的相互轉化，半衰期為8天，相互轉化自由能壘為26kcal/mol，這將極大地使(R)-18作為純物質的發展複雜化，如下圖6所示[4]。
圖6.化合物18阿託異構體在25°C時構型不穩定
啟動三種策略來識別具有阿託異構體構型特性的先導化合物，以適合藥物開發需要。這些策略包括：(1)提高阿託品異構體相互轉化的能量勢壘，以形成單一的純阿託品；(2)降低相互轉化勢壘，以形成自由相互轉化的阿託混合物；或(3)使隱袋取代基對稱，以避免手性軸的產生。經過研究(R)-24成為隨後在異種移植模型中進行藥效學和有效性測試的主要候選藥物[4]。
圖7.阿託異構體穩定性和KRASG12C活性與隱袋芳烴特性和取代方式的關係
檢測(R)-24對體內KRAS信號轉導的影響，將(R)-24口服給裸鼠皮下接種MIA-Paca-2T2人腫瘤細胞(純合KRASp.G12C)，觀察(R)-24對KRAS信號轉導的影響。血清和腫瘤樣本在給藥2小時後收集，顯示(R)-24在不同劑量(10-100 mg/kg)之間呈劑量比例暴露，在低劑量(30 mg/kg)時最大限度地抑制了下遊ERK的磷酸化(圖8a)。30 mg/kg劑量組的游離血漿和總腫瘤暴露(分別為3和11 nM)明顯低於體外p-ERK IC50(28 nM；孵育2小時後測定)，這提供了一個初步的跡象，表明KRAS G12C的共價失活可能具有持久的下遊效應，即使在沒有循環藥物的情況下也是如此。隨後在裸鼠移植瘤有效性研究中使用相同的方法對(R)-24進行了分析。(R)-24在腫瘤建立後兩周內每天口服一次(10-100毫克/公斤)，在30毫克/公斤劑量下完全抑制腫瘤生長，在60毫克/公斤劑量下引起腫瘤消退(圖8b)。(R)-24在裸鼠體內的時程PK研究(30mg/kg，PO)再次證實了早期PK/PD研究的結果，表明體外2h p-ERK IC50的體外處理<2-3h足以實現腫瘤生長停滯(圖8c) [4]。
圖8.(R)-24動物試驗結果
隨後研究發現(R)-24晶型與早期研究中使用的非晶型相比，口服生物利用度顯著降低(4-12%)時，這削弱了在未來研究中實現適當血漿暴露的能力。由於生物利用度降低的同時，生物懸浮介質中的溶解度也大幅降低，因此優先確定具有優異水溶性的(R)-24類似物。採用兩種策略：(1)通過改變喹唑啉酮C6滷素取代基降低(R)-24的親脂性，(2)通過在隱袋環中引入額外的氮原子來增加(R)-24的極性表面積，如下圖9所示[4]。
圖9.(R)-24的生物製藥優化顯著提高了生物利用度
最初集中在將氮原子加入到神秘的口袋環中。用氮原子(見化合物34和35)取代異丙基或甲基取代基附近的碳原子顯著提高了水的溶解性，而不會明顯改變KRAS的活性。然而，這種替代也大大降低了MDCK的滲透性，提供了沒有可測量的口服生物利用度的分子(BALB/c小鼠)。雖然雙氮取代(36)同樣進一步提高了水的溶解性，但所得到的嘧啶類似物同樣具有低滲透性，並且沒有可測量的口服生物利用度。接下來研究了降低喹唑啉酮C6取代基的親脂性是否可以在保持細胞活性的同時提高水的溶解性。雖然用氟取代基(R)-24的C6氯取代基(化合物37)導致細胞分析中的活性略有下降(例如，p-ERK IC50=90 nm)，但這一改變也導致水溶解度略有增加(~3倍)，並且對膜的通透性沒有不利影響。但(R)-37沒有顯示出任何可測量的口服生物利用度(%F<0.5)。然而，將C6氟取代與隱蔽口袋芳烴環(化合物38-40)中的氮摻入相結合，克服了之前類似物一貫的低生物利用度。雖然氮原子的加入再次導致所有三種化合物的MDCK滲透率顯著降低，但這一特性的結合顯著提高了水的溶解度(在所有生物懸浮介質中均大於423µM)。從這些研究中，(R)-38成為突出的分子，在細胞分析中表現出良好的活性(p-ERK IC50=68 nm)，中等滲透性(PAB=6 µcm/s)，以及出色的口服生物利用度(晶態為22-40%)，如上圖9所示[4]。
令人滿意的是，(R)-38在裸鼠MIAPaca-2異種移植模型中口服(0.3100 mg/kg)時呈現劑量比例的血漿暴露，並在劑量≥10 mg/kg時顯著抑制ERK磷酸化(圖10a)。進一步研究(R)-38的PK/PD關係，在異種移植模型中進行了時程藥效學研究(圖10b)。研究支持了(R)-24和(R)-38的早期結果，表明雖然ERK磷酸化在給藥後60-120分鐘得到最大程度的抑制，但(R)-38血漿和腫瘤暴露在給藥後30分鐘達到峰值，到120分鐘的時間點，循環中只有低濃度的(R)-38保持不變[4]。
圖10.化合物(R)-38的P-ERK(a)劑量反應和(b)血漿和腫瘤暴露的時程(MSD)
由於藥效學效應的鼓舞，在一項使用MIA Paca-2 T2(p.G12C)腫瘤細胞進行的小鼠異種移植療效研究(R)-38。每天一次口服劑量(10-100 mg/kg)在10 mg/kg時腫瘤生長抑制率達86%，在≥30 mg/kg劑量下腫瘤消退顯著(圖11a)。這項研究的非結合血漿暴露(圖11b)再次表明，考慮到共價抑制劑的作用機制，在沒有持續藥物暴露的情況下，可以實現持久的生長反應。在10 mg/kg劑量下，體外p-ERK IC50的血漿覆蓋率僅維持1h，給藥後8h循環遊離濃度已降至1 nM以下。儘管如此，體外p-ERK IC50的1h覆蓋足以使腫瘤生長接近停滯，而體外IC50覆蓋僅2h(30 mg/kg劑量)就足以引起腫瘤的消退[4]。
圖11.a.化合物(R)-38對MIA-Paca-2T2裸鼠移植瘤生長的影響(qd，PO劑量)。b.平均游離血漿濃度
對(R)-38進行了進一步的表徵，以評估其作為可能的開發候選藥物的潛力。與KRASG12C的共結晶揭示了(R)-38採用了類似於先前喹唑啉酮先導化合物的結合模式，(R)-38的喹唑啉酮核心佔據了KRASSwitch II口袋，丙烯醯胺部分與C12形成了共價鍵，如下圖13所示。(R)-38的(S)-甲基哌嗪環採用螺旋船構象，C2甲基取代基與C12和Y96緊密接觸。關鍵的是，吡啶環的異丙基再次與Y96、H95和Q99緊密接觸，很大程度上填滿了H95殘基的側鏈旋轉所揭示的隱蔽口袋，並有助於該分子的效力。同時也沒有發現隱蔽口袋芳環的氮取代對強效R-阿託的構型穩定性產生不利影響，如下圖14所示[4]。
圖13. 化合物(R)-38與GDP-KRASG12C(青藍)鍵合的X射線晶體結構
圖14. 化合物(R)-38的額外體外和PK表徵;(R)-38化合物結構
基於(R)-38令人信服的藥理學特徵及其顯著的體內消退KRAS p.G12C突變腫瘤的能力、良好的生物藥劑學特性以及在臨床前毒理學模型中出色的耐受性，Amgen於2018年將(R)-38 (AMG 510)進行臨床開發。目前AMG 510已經進行到臨床三期，在之前的臨床試驗中已經顯示出一定的臨床潛力。
KRAS開發從不可成藥的魔咒，到Shokat和Matthew R. Janes等科學家帶來的曙光乍現，再到AMG-510的高歌猛進，經歷了時光，更經歷了時光裡的一場場風風雨雨，但到此KRAS的開發並沒有結束，未來是晴空萬裡還只是短暫的狂歡？
參考文獻：
1. Ostrem, J. M.; Peters, U.; Sos, M. L.; Wells, J. A.; Shokat, K. M.K-Ras(G12C) Inhibitors Allosterically Control GTP Affinity and Effector Interactions. Nature 2013, 503, 548–551.
2. Janes M R , Zhang J , Li L S , et al. Targeting KRAS Mutant Cancers with a Covalent G12C-Specific Inhibitor[J]. Cell, 2018, 172(3):578-589.
3. ACS Med. Chem.Lett. 2019, 10, 1302–1308.
4. Lanman B A , Allen J R , Allen J G , et al. Discovery of a covalent inhibitor of KRASG12C (AMG 510) for the treatment of solid tumors[J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2019.