冷凍電鏡在膜蛋白結構研究中的應用、優勢與展望——訪荷蘭...

2020-11-30 儀器信息網

在分子水平上，一個生物體的生理功能在很大程度上由它所表達的蛋白質決定，並且在大多數疾病病例中，蛋白質的功能失常往往是疾病的根本原因。

與傳統的故障排查和維修一樣，蛋白質的功能失常要找到問題根源進行修復，必須了解它是如何構建的，以及維持其各個功能的組件。而冷凍電鏡技術（cryo-EM）正是可以幫助我們解讀蛋白質等重要細胞機制的結構生物學。

近期，國外媒體採訪了格羅寧根大學(University of Groningen) 結構生物學系高解析度cryo-EM負責人Cristina Paulino（助理教授），請其介紹了cryo-EM在其團隊研究膜蛋白結構和功能方面所發揮的重要作用。

媒體：研究膜轉運蛋白的機制及結構的重要意義？您通常研究哪些特定類型的膜轉運蛋白？為什麼？

Cristina Paulino（CP）：獲得結構性見解是解開蛋白質作用機制的基礎。將蛋白質功能和生理數據相結合時，我們能夠詳細了解這些蛋白質如何運作，了解它們為什麼以及如何發生故障，疾病的原因是什麼以及我們如何解決它。我喜歡將蛋白質結構比作「組裝機器的藍圖」。雖然遺傳學和生物化學有助於理解蛋白質的生理作用，但結構生物學揭示了這些納米機器的外觀以及它們的連接方式。只有這樣，我們才能理性地理解它們並利用這些知識來修復、設計或阻止它們。例如，基於結構的藥物設計等。

我的研究重點是闡明嵌入膜中的蛋白質的作用機制，特別是膜轉運蛋白和通道的作用機制。儘管膜蛋白具有高藥理學相關性（目前超過60％市售藥物的目標膜蛋白），但對膜蛋白的結構-功能-關係的研究還很少，需要生物學、化學和物理學等跨學科方法交叉研究。

雖然我的小組主要研究關於這些蛋白質如何發揮作用的基本問題，但研究結果可以帶來額外的社會經濟應用。這在我們對人類ASCT2的研究中得到證實，人類ASCT2是人體細胞中穀氨醯胺攝取的主要來源，與癌細胞生長，患者生存率低以及癌症治療的新熱靶點密切相關。除了解開其運輸機制細節的工作外，我們還與藥物化學家合作，以確定新的抑制劑並指導基於結構的藥物設計。其他研究模糊了傳統運輸機制中存在的傳統概念邊界。例如，KdpFBAC複合物，即細菌中的緊急鉀攝取系統，結合了主要活性轉運蛋白和通道的特徵。在TMEM16家族中，成員既可以作為鈣激活的氯離子通道，也可以作為脂質打亂酶，甚至兩者兼而有之。我們的研究表明，在進化過程中，保守蛋白結構不僅相互進化，而且可以融合在一起，以適應不同的環境和細胞需求。

TMEM16家族的膜蛋白研究成果發表在2019年3月12日的eLife期刊上的兩篇背靠背論文中

媒體：cryo-EM對你工作的重要性如何？對團隊能力提升有哪些影響？

CP：在過去幾年中，cryo-EM已被證明是結構生物學中不可或缺的技術，提供了超過X射線晶體學的幾個優點，即(i)只需要少量的蛋白質; （ii）不受蛋白質晶體形成的限制;(iii)幾乎不受緩衝成分的限制，並允許在凍結前誘導構象變化;(iv)不受樣本成分或構象異質性的影響，使我們得以一窺結構動力學; （v）能夠確定低解析度和高解析度結構;(vi)允許使用模擬天然脂質環境的工具，如納米盤。值得注意的是，雖然冷凍電鏡獲得的解析度平均低於x射線晶體學，但對於膜蛋白獲得的共同解析度是相似的（約3-4埃）。事實證明，這些優勢對於解決使用膜蛋白時面臨的幾個挑戰至關重要，可以進行前所未有的研究，並使cryo-EM成為研究膜蛋白結構的首選技術。因此，cryo-EM是我們小組採用的主要技術。

媒體：使用cryo-EM推斷一個膜蛋白結構的實驗周期大概需要多久？

CP：在比較理想環境條件下，有一個比較理想的樣品，一個性能良好的高端顯微鏡，有一套強大的圖像處理集群，你可以在幾天內解決一個高解析度的結構。然而，在現實實驗中，特別是在處理具有挑戰性的膜蛋白時，時間周期通常是幾周或幾個月。

媒體:你最近用cryo-EM測定了TMEM16蛋白家族的結構。在新聞稿中，您聲明這種方法「允許您對活動結構動態進行採樣」。能詳細談談嗎?為什麼cryo-EM優於其他可用的方法?

CP: cryo-EM的優點之一是樣品經過震蕩冷凍，保留了溶液中的所有構象。這與x射線晶體學形成了強烈的對比，x射線晶體學的定義是，晶體中的所有蛋白質都處於相同的狀態，而這種狀態通常局限於能量優先構象。此外，我們還可以在圖像處理的層面上處理cryo-EM圖像中存在的構象異質性。因此，我們可以從相同的樣品中確定蛋白質在溶液中的幾種結構，它們代表不同的功能狀態。在我們最近關於脂質scramblase TMEM16的研究中，我們能夠在激活條件下獲得幾種超燃酶結構。我們將這些不同的構象解釋為該蛋白逐步激活機制的快照，並提出其中一種中間狀態可能與某些TMEM16蛋白中觀察到的非選擇性離子傳導有關。

媒體:在您的研究領域裡使用cryo-EM有什麼限制嗎?如何才能克服這些限制?

CP: cryo-EM在過去幾年裡發展得如此之快和如此之多，我感到非常興奮。儘管該技術不斷地重新定義其局限性並變得更加用戶友好，但我們仍然面臨一些挑戰。然而，對於x射線晶體學來說，獲得完全可操作和維護的同步加速器束流線基本上是免費的，而cryo-EM的總體成本和操作所需的專業水平一直是一個障礙。在一定程度上，政府對cryo-EM設備的補貼緩解了這一問題，但並沒有完全解決。

在我的小組中，我們有一個內部的高端cryo-EM供我們使用，我們確保對所有小組成員進行徹底的培訓。其他障礙包括圖像處理集群的獲取和成本、數據管理(每天可以記錄幾個TB數據)和圖像處理方面的專門知識。幸運的是，它的成本隨著時間的推移而降低，而圖形處理單元驅動軟體的實現使成本保持在可承受範圍內。當然，樣品製備有很大的改進空間(例如，需要更少量的蛋白質並避免空氣 - 水界面)，幾個團隊和公司正在致力於解決這個問題。

最後，解決一個結構所需的總時間，以及尺寸和平均解析度的限制，仍然對基於結構的藥物設計所需的高通量方法構成挑戰和阻礙。這些問題正在通過結合更穩定的電子顯微鏡、更好和更有效的電子探測攝像機和改進的處理算法得到解決。

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