撰文丨納米技術
校審丨未央
2017年，諾貝爾化學獎授予Jacques Dubochet, Joachim Frank和Richard Henderson三位科學家，以表彰他們在冷凍電鏡領域的貢獻。冷凍電鏡使得高解析度觀測蛋白質等活性生物大分子結構成為可能，為結構生物學迎來了一個嶄新的時代。
20世紀70年代以來，冷凍電鏡的發展已有數十年歷史，它通過在電子樣品上發射電子並記錄所得圖像來確定其形狀。這使得蛋白質結構比以往任何時候都更清晰，幾乎與X射線晶體學獲得的結構一樣好，X射線晶體學是一種更古老的技術，當蛋白質晶體受到X射線轟擊時，它會從蛋白質晶體的衍射圖案中推斷出結構。
2013年以來，冷凍電鏡一直在尋找突破，以擺脫X-射線晶體學，成為結構生物學領域的絕對霸主。但是，它還存在一個關鍵問題懸而未決：解析度不夠高！
2020年5月22日，來自德國馬克斯·普朗克生物物理化學研究所的生物化學家和電子顯微鏡學家Holger Stark團隊，和英國劍橋分子生物學醫學研究委員會實驗室(MRC-LMB)的結構生物學家Sjors Scheres和Radu Aricescu領導的團隊，分別在bioRxiv預印本同時發表文章，報導了一項激動人心的結果。2020年10月22日，這兩個課題組在Nature背靠背發表論文，正式向全世界宣告了這一革命性的突破：第一次看見蛋白質中的單個原子。蛋白分子的三維精確原子結構解析對生物學領域中生理過程機理研究至關重要，對原子結構、配位環境更加精確的理解能夠對蛋白功能作用過程和機制進一步理解。隨著硬體和軟體進步，雖然冷凍電鏡結構解析度得到進一步提高，但是仍然難以在較高的解析度中對每個原子成像。因此，科學家們在很大程度上還是要依賴於X射線晶體學來獲得原子解析度的結構。這就產生了一個關鍵問題：研究人員可能要花費數月至數年的時間才能使蛋白質結晶，此外，許多醫學上重要的蛋白質也無法形成有用的晶體。相比之下，冷凍電子顯微鏡只需要蛋白質在純化溶液中即可。原子解析度圖的精確度足以精確識別蛋白質中單個原子的位置，解析度約為1.2 Å（1.2´10-10 m）。這些結構對於了解酶的作用方式以及利用這些見解來識別可阻斷其活性的藥物特別有用。為了推動冷凍電鏡達到原子解析度，兩個團隊致力於一種名為脫鐵鐵蛋白（apoferritin）的儲鐵蛋白質的研究。由於其巖石般的穩定性，這種蛋白質已經成為冷凍電鏡的專屬實驗樣品：之前的紀錄是解析度為1.54 Å的蛋白質結構。劍橋大學A. Radu Aricescu、Sjors H. W. Scheres等；馬克斯·普朗克生物物理化學研究所Holger Stark等報導了對冷凍電子顯微鏡的固件、拍照方法升級，主要通過更換電子源、電子能量過濾器、調整照相過程，實現了解析度的優化。馬普所Holger Stark等通過球差校正、含有能量過濾器的單色儀結合、將照射到樣品上的電子的能量限定在一定範圍內，實現了對成像解析度的改善。劍橋大學A. Radu Aricescu、Sjors H. W. Scheres等藉助冷場發射電子槍優化入射電子的品質，同時將對樣品成像作用有害的電子篩除，降低了噪音對樣品成像的影響，還使用了新型高靈敏度電子探測器進行成像。最終，研究人員在對人膜蛋白進行成像的過程中實現了1.7 Å的解析度，加強了對對人膜蛋白中小分子配位環境、溶劑分子、胺基酸的多種構象、酸性側鏈/聚糖的確切結構進行理解。在對去鐵鐵蛋白進行成像的過程中，實現了1.22 Å的解析度。雖然還不能看到氫原子，但是能夠對大量氫原子的散射勢壘進行成像，幫助研究者探索蛋白的氫鍵網絡結構。無論是生物，還是化學、材料研究中，原子尺度的精準表徵，都對分子和原子結構的排列、組成、構建的研究至關重要。只有取得了分子的精確結構和組成，才能對生理學、化學過程進行直觀明確的驗證。冷凍電鏡除了在生物研究中大顯身手，在材料和化學領域也能夠實現傳統透射電子顯微鏡技術無法實現的應用，包括電池界面電極/電解質觀測、有機/無機界面觀測、DNA/超晶格自組裝、催化、MOF材料、量子材料等。然而，和X射線晶體學技術相比，冷凍電鏡不僅通量小，而且價格貴，維護成本高。這些優勢使X射線晶體學更適合於科學研究。為了讓冷凍電鏡不那麼讓人高攀不起，科學家一方面追逐更高的解析度，一方面也在追求更快速、更便宜、更好用的冷凍電鏡技術。2019年12月26日，顏寧教授團隊簡單改變了石墨烯grids的製備方法，幫助冷凍電鏡上了一個新臺階。他們採用一種簡單的策略，可製備出單層石墨烯覆蓋率高達99％的冷凍電鏡專用網格，超過70％的網格可用於採集有效數據，從11000個顆粒中，研究團隊以目前最小的蛋白質為例，獲得了超高解析度：2.6 Å（也就是0.26 nm）。為了增加冷凍電鏡處理數據的通量，並極大地降低成本以加速科學研究發現，MRC分子生物學實驗室Christopher J. Russo等人報導了一種全新的支撐膜，不僅可以提高圖像質量和收集效率，而且成本大幅降低。與傳統支撐膜相比，HexAuFoil的核心設計在於：
1）使這些孔變小（直徑為200至300 nm），並將它們更緊密地堆積在一起，這樣極大地提高了數據通量。每次載物臺移動可獲取200張圖像，使用適當配置的顯微鏡，甚至可以獲取多達800張圖像。2）通過最大程度地減少輻射損壞和樣品移動造成的信息損失，來提高數據質量。分析表明，成像過程中樣品運動的主要原因是玻璃化冰層的彎曲。於是，研究人員根據孔徑，設計了具有最佳基材厚度的支撐膜，從而將樣品在曝光過程中的總運動幅度降低至<1 Å。這樣，研究人員可以在樣品被輻射損壞之前，用數學方法將數據構建成到三維地圖。1）這項技術，讓冷凍電鏡的原子級解析度更加普適，可以應用於更多不穩定的蛋白質。正如上文提到，德國馬克斯·普朗克生物物理化學研究所的生物化學家和電子顯微鏡學家Holger Stark團隊，和英國劍橋分子生物學醫學研究委員會實驗室(MRC-LMB)的結構生物學家Sjors Scheres和Radu Aricescu使用標準支撐膜，第一次真正實現了原子級冷凍電鏡重建，但是他們所使用的是一種穩定的蛋白質：脫鐵鐵蛋白。使用軟體校正光束，可以調控運動對圖片質量和解析度的影響，但是無法提供更高的數據處理通量。
在原子尺度的解析度下，解析度每提高半個Å，就會打開一個新的宇宙。真正的原子解析度，加上更加務實和親民的操作和價格，這些不斷取得的新突破，將進一步推動冷凍電鏡作為大多數結構研究的霸主地位。然而，在科學的世界，沒有神壇，也沒有什麼能夠永遠稱霸天下。每種技術仍然有優缺點，冷凍電鏡想要完全取代X射線晶體學，為時尚早！【1】Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM, Nature 2020DOI: 10.1038/s41586-020-2833-4https://www.nature.com/articles/s41586-020-2833-4【2】Nakane, T., Kotecha, A., Sente, A. et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution, Nature 2020DOI: 10.1038/s41586-020-2829-0https://www.nature.com/articles/s41586-020-2829-0【3】Mark A. Herzik Jr, Cryo-electron microscopy reaches atomic resolution, Nature 2020DOI: 10.1038/d41586-020-02924-yhttps://www.nature.com/articles/d41586-020-02924-y【4】Katerina Naydenova et al. Cryo-EM with sub–1 Å specimen movement. Science 2020, 370, 223-226.https://science.sciencemag.org/content/370/6513/223【5】Yimo Han, Nieng Yan et al. High-yield monolayer graphene grids fornear-atomic resolution cryoelectron microscopy. PNAS 2019.https://www.pnas.org/content/early/2019/12/24/1919114117
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