青蛤是我國傳統的經濟養殖貝類，近年來，隨著不斷擴大的增養殖規模、日益加深的集約化程度以及不斷惡化的養殖環境，青蛤的大規模病害和死亡現象日漸增多。
貝類屬於非特異性免疫系統，其中Toll樣受體是非特異性免疫反應中一類重要的識別受體，在對抗病原物的侵染過程中起著關鍵作用。MAPK家族是TLRs信號通路中的重要成員之一，它作為介導細胞反應的一種重要信號系統，參與了細胞間多種生化反應信號的識別、傳遞以及放大等處理過程。p38是MAPKs通路的主要蛋白之一，它的激活途徑很保守，屬於典型的3級激酶級聯反應磷酸化激活途徑。
目 的
克隆青蛤MAPK/p38基因，並分析其在Poly：Ic脅迫下的表達情況。探究MAPK/p38在MAPKs信號通路中的作用，為探索絲裂原活化蛋白激酶所參與的青蛤免疫機制提供重要的試驗數據，並為選育貝類新品種、開發疫苗提供理論依據，減少其養殖過程中的大規模死亡現象，從而推動沿海地區的經濟發展。
方 法
利用轉錄組測序獲得青蛤MAPK/p38基因的序列信息，採用生物信息學軟體分析該基因在近緣生物間的進化關係；利用巢式及螢光定量PCR技術克隆青蛤MAPK/p38基因的結構域序列，並在Poly：Ic脅迫後立即分析該基因在青蛤各組織中的表達情況以及血淋巴中的時序性表達情況。
結 果
克隆得到青蛤MAPK/p38基因的結構域序列，分析發現該基因在物種進化中很保守，其在青蛤的血淋巴、肝臟、外套膜、閉殼肌和鰓中均有表達，其中在血淋巴中表達量最高，腮中表達量最低。Poly：Ic脅迫3h後該基因的表達量達到最大值，與對照組差異極顯著（P<0.01）。
◆青蛤MAPK/p38基因的生物信息學分析
分析顯示MAPK/p38基因無跨膜區，為完整的胞內蛋白；其信息傳遞序列位於第30~40個胺基酸；有一個完整的激酶結構域：S-TKc，位於第27~311個胺基酸；建立系統發育樹（圖1），青蛤的MAPK/p38基因與光滑雙臍螺的親緣關係最近。
圖1 青蛤MAPK/p38基因和其他物種的MAPK/p38基因胺基酸序列構建的系統樹
◆青蛤MAPK/p38基因結構域的克隆
採用PCR技術擴增得到青蛤MAPK/p38基因的結構域序列（圖2），結構域序列長855bp。擴增體系為25μL，其反應程序為95℃預變性30s，94℃變性5s，60℃退火1min，72℃延伸30s，40個循環。
圖2 青蛤MAPK/p38基因結構域的克隆結果
◆青蛤MAPK/p38基因在不同組織間的表達
以β-actin基因在各組織中的表達量為內參對照，利用實時螢光定量PCR分析MAPK/p38基因在青蛤剛剛注射Poly：Ic後其血淋巴、肝臟、外套膜、閉殼肌和鰓5個組織中的表達情況，結果表明該基因在以上組織中普遍表達（圖3），但表達量有明顯不同，在血淋巴中表達量最高，與其他組織相比差異極顯著（P＜0.01），鰓中表達量最少。
圖3 MAPK/p38基因在青蛤不同組織中的表達分布
◆Poly：Ic刺激下青蛤MAPK/p38基因在血淋巴中的時序性表達
以β-actin基因為內參基因，用實時定量螢光PCR技術分析被Poly：Ic侵染後的青蛤MAPK/p38基因在血淋巴中表達的時序性變化。結果表明：表達量達到最大值時為刺激3h後，與對照組相比存在極顯著差異（P<0.01），之後的數值逐漸下降，最後趨於正常水平（圖4）。
圖4 Poly：Ic刺激下青蛤MAPK/p38基因在血淋巴中的時序性表達結果
結 論
青蛤受到外界因素脅迫後，其血淋巴中MAPK/p38基因表達在較短時間內至最大值，說明病原物能夠識別並誘導TLRs免疫受體及下遊MAPK/p38信號通路蛋白，而後使其血液中合成相應的免疫信號蛋白，防止機體自身受到外來脅迫物的侵害。同時，MAPK/p38基因的表達量大體上呈現先升高後降低的趨勢，證明MAPK/p38基因參與了非特異免疫的全部過程。該試驗結果為探索絲裂原活化蛋白激酶所參與的青蛤免疫機制提供了重要的試驗數據，並為選育貝類新品種、開發疫苗提供相應的理論依據。