幾丁質酶基因的克隆,與表達分析,以及對脊尾白蝦的講解

2021-01-09 李景瑞說時尚

甲殼類幾丁質酶基因(Chi)屬於18家族糖苷鍵水解酶多家族基因( Zhang et al,2014),其基本功能可以特異降解幾丁質。除此之外,Chi在甲殼動物中還具有其他重要的生理功能,包括消化幾丁質類食物以及參與免疫防禦等( Zhang et al,2014; Arakan et al,2010)。

相比昆蟲而言( Arakan et al,2010; Zhu et al,2008Zhang et al,2011),由於缺少基因組背景,甲殼類Chi研究開展較晚,然而由於其重要性,近幾年已成研究熱點。日前在中國對蝦( Fenneropenaeus chinensis)、凡納濱對蝦( Litopenaeus vannamei)、日本仿長額蝦( Pandalopsis japonica)以及日本沼蝦( Macro brachium ni p ponense)中均已開展Chi基因克隆、分類及功能研究。研究表明:甲殼類幾丁質酶基因至少分六類(陳少波等,2004)。

可能在甲殼類免疫功能中發揮重要作用(luang et al, 2010; Proespraiwong et al, 2010; Zhang et al, 2010; Rocha et al, 2012Zhang et al,2014)以期探討 Ecchi基因在脊尾白蝦免疫應答反應中的作用機理。脊尾白蝦幾丁質酶EcCh某因cDNA全長1319bp,EcChi胺基酸序列包含1個19個胺基酸殘基組成的信號肽,相對分子質量大小為43.71×103,理論等電點4.78。

EcCh胺基酸序列含有1個幾丁質酶家族活性位點1 FDGLDMD wEl『,1個糖苷水解酶催化域和1個插入域。 BLASTP比對結果顯示,脊尾白蝦 EcChi胺基酸序列與 Pandalopsis ja ponica、鋸緣青蟹( Scylla serrate)、凡納濱對蝦(L.van-namea)和中國對蝦( Fenneropenaeus chinensis)的相似性分別為77%、65%、62%和62%系統進化分析表明,脊尾白蝦 EcChi與其他甲殼類Chi3緊密聚合在一起,表明脊尾白蝦EcChi更接近於幾丁質酶3亞型。

脊尾白蝦幾丁質酶 EcChi基因 Genbank登錄號:KF548041。螢光定量RT-PCR分析結果顯示,脊尾白蝦 EcChi基因的表達具有組織特異性,在血細胞、鰓、肝、肌肉、卵巢、腸、胃和眼柄中都有表達(圖179)。其中,在肝中的相對表達量最高。 Zhang et al(2010)研究表明,肝是合成幾丁質酶的主要場所,用於降解吸食物中的甲殼素。脊尾白蝦EcCh基因在肝中的高表達量情況,與中國對蝦、P. Ja ponica( Salma et al,2012)、中國對蝦( Zhang et al,2010)和凡納濱對蝦( Huang et al,2010)中的研究結果一致。

鰻弧菌和wSSⅴ均是蝦類養殖中常見的病原,會破壞養殖動物的免疫系統。研究表明,Chi3基因在日本囊對蝦中與抗WssⅤ相關( Pan et al,2005)。為了研究脊尾白蝦EcCh在免疫應答中的作用,本研究設計了細菌和病毒的攻毒實驗,採用鰻弧菌和WSSV分別注射脊尾白蝦,研究了脊尾白蝦EcCh在血細胞和肝中的表達量。研究表明,血細胞和肝可以合成免疫物質用於清除侵入機體的病原,在甲殼類免疫應答反應中發揮重要作用( Lemaitre and hoffmann,2007)。表明 cchi基因可以被鰻弧菌感染誘導表達,合成幾丁質酶蛋白用於修復機體損傷的蛋白。

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