「作為新概念抗新冠病毒藥物，二氫乳清酸脫氫酶（DHODH）的抑制劑來氟米特於2020年5月29日獲得全球醫藥創新領域知名公益科研機構英國生命愛科（LifeArc）的全額資助（150萬英鎊），用於與英方臨床專家共同負責開展國際多中心臨床試驗研究（DEFEAT-COVID study），李洪林教授是該臨床試驗的發起人和首席科學家，目前已獲得英國藥品和保健品管理局(MHRA)的臨床試驗批文，開始在Ashford and St Peters Hospital招募COVID-19病人。」
點評 | 許葉春（中科院上海藥物所研究員）、蔣華良（中國科學院院士、中科院上海藥物所研究員）
SARS-CoV-2、SARS-CoV、Zika、MERS-CoV、Ebola、H7N9等RNA病毒在局部地區/世界範圍內的大規模爆發流行，給人們的生命健康帶來嚴重危害的同時，也對國家及世界的經濟發展帶來巨大的衝擊。截至目前，新冠病毒已在全球感染達2000萬人，並致73萬人死亡，但是目前仍沒有研製出特效疫苗和抗病毒藥物。病毒肆虐之下，尋找治療新冠肺炎的高效、低毒藥物，仍是目前全球範圍內對抗新冠病毒的當務之急。
2020年8月4日，華東理工大學藥學院/上海市新藥設計重點實驗李洪林團隊和武漢大學病毒學國家重點實驗室徐可團隊合作在Protein & Cell發表研究「Novel and potent inhibitors targeting DHODH are broad-spectrum antivirals against RNA viruses including newly-emerged coronavirus SARS-CoV-2」，報導了靶向宿主細胞的二氫乳清酸脫氫酶（DHODH）抑制劑能夠通過抑制病毒基因組複製和調節免疫兩種途徑發揮廣譜抗病毒藥效，且所設計的兩個新型DHODH抑制劑S312和S416在細胞水平表現出高效的抗新冠病毒活性，其中S416是目前已報導的體外抑制活性最強的抗新冠病毒候選新藥。
病毒的複製周期包括吸附、穿入、脫殼、核酸和蛋白質合成、裝配和釋放五個步驟。根據現有抗病毒藥物作用的對象不同，可將其分為靶向病毒（Direct Acting Antivirals Agent，DAA）和靶向宿主細胞（Host-Targeting Antiviral, HTA）的藥物。靶向病毒顆粒的DAA藥物是針對病毒複製周期的一個或幾個過程而設計的藥物，如靶向流感病毒膜吸附融合的藥物阿比朵爾、靶向病毒囊膜的藥物恩夫韋地和氯喹、靶向冠狀病毒（CoV）S蛋白的在研藥物GLS-5300、作用病毒脫殼釋放核酸階段的金剛烷胺類抗流感病毒藥物、作用病毒核酸複製階段的藥物（如逆轉錄酶抑制劑拉米夫定、整合酶抑制劑拉替拉韋、RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）抑制劑法匹拉韋和瑞德西韋）、作用病毒蛋白質翻譯和裝配階段的藥物如HIV蛋白酶抑制劑洛匹那韋、作用成熟子代病毒釋放階段的藥物如流感病毒神經氨酸酶抑制劑奧司他韋等。由於DAA藥物具有病毒特異性，已有的DAA藥物對新發病毒的治療效果受限或完全無效（如阿比朵爾、氯喹、法匹拉韋，洛匹那韋和瑞德西韋等治療COVID-19不盡如人意的臨床表現），而重新研發新的DAA藥物也是「遠水解不了近渴」。相比較而言，靶向宿主因子的HTA藥物在控制新病毒疫情上具有明顯優勢。病毒是寄生生物，必須依賴宿主細胞的原料和機器進行核酸及蛋白質生產及加工以完成複製，HTA藥物不僅可有效抑制病毒核酸的快速複製，而且能對抗病毒耐藥突變，做到「以不變應萬變」。因此，具有廣譜抗病毒藥效的HTA藥物研發一直是抗感染新藥研發領域追求的目標。但由於此類藥物靶向於宿主，需更多考慮安全性及體外-體內藥效轉化差等問題，因此，此類藥物的研發往往事倍功半，勞而少功。
嘧啶鹼基是病毒RNA/DNA複製的必需原料，故靶向嘧啶核苷酸合成途徑的HTA藥物是近年來廣譜抗病毒藥物的研究熱點。針對嘧啶核苷酸合成途徑，目前雖有一些活性化合物被報導，但它們大多數沒有明確的作用靶點，即便明確了作用靶點，但也基本都以動物體內無效或效果不顯著而折戟沉沙。
二氫乳清酸脫氫酶（DHODH）位於線粒體內膜的外側面，是催化嘧啶核苷酸從頭合成途徑第四步氧化還原反應的關鍵酶，那些快速增殖的細胞（淋巴細胞和腫瘤細胞等）或病毒複製，需要依賴從頭合成途徑來大量合成嘧啶核苷酸以滿足細胞增殖或病毒複製對核酸的需求，因此，可以通過抑制DHODH的活性，來抑制嘧啶鹼基的從頭合成，從而抑制快速增殖的淋巴細胞/腫瘤細胞或病毒的DNA和RNA的生物合成，起到抗自身免疫性疾病，抗癌和抗病毒的作用。以DHODH為靶標的抑制劑目前只有兩個FDA批准的藥物上市即來氟米特和特立氟胺（即來氟米特的體內活性代謝產物A771726），分別用於類風溼性關節炎和多發性硬化症的治療。針對DHODH靶點，已20多年無新藥上市，近年來雖不斷有新型DHODH抑制劑被報導，但是它們多數對DHODH的抑制能力欠缺或在動物模型上未能表現出明顯的治療效果而限制了它們進一步的開發和使用。DHODH靶點雖然具有開發成廣譜抗RNA病毒的潛力，但其抑制劑在體內廣譜抗病毒方面的應用可行性一直懸而未解。
李洪林團隊和徐可團隊經過多年的深度合作，聯合攻關，在靶向宿主的廣譜抗病毒候選藥物研究方面取得了重要進展。
李洪林團隊前期發展了多種藥物設計方法，針對DHODH靶點，設計了兩個新型強效候選藥物S312和S416，它們在分子水平上抑制DHODH的IC50值分別為29.2 nM和7.5 nM，與DHODH結合的KD值分別為20.3 nM和1.69 nM，且表現出快結合慢解離等良好的成藥性質（圖1）。
圖1. 新型高效DHODH抑制劑的發現與設計
聯合徐可團隊，本文驗證這兩候選藥物與已有DHODH抑制劑——來氟米特（Leflunomide）和特立氟胺（Teriflunomide）均顯示出對多種RNA病毒的廣譜抗病毒活性，包括A型流感（H1N1，H3N2，H9N2），Zika和Ebola病毒（細胞水平EC50範圍為0.013~35.02 μM），且S312和S416體外抗病毒效果均優於特立氟胺（圖2）。在此文章寫作過程中，正值國內新冠疫情爆發，基於前期的研究結果和作用機制分析，合作團隊迅速響應開展了針對抗新冠病毒的活性測試。
圖2. DHODH抑制劑的廣譜抗病毒活性
結果表明兩候選藥物S416和S312抗新冠病毒EC50分別為0.017 μM（SI > 10505.88）和1.56 μM （SI>101.41）。S416細胞試驗抗病毒作用比瑞德西韋（EC50 = 0.77 μM，SI > 129.87）強45倍；比氯喹（EC50 = 1.13 μM, SI > 88.5）的活性強60餘倍，是目前已報導的體外抑制活性最強的抗SARS-CoV-2候選化合物（圖3）。
圖3. DHODH抑制劑（A-B）與法匹拉韋，瑞德西韋和氯喹等抑制劑（C）的細胞水平抗SARS-CoV-2藥效比較
同靶點的現有老藥來氟米特及活性代謝產物特立氟胺，在體外抗SARS-CoV-2病毒的EC50藥效（EC50 = 6.001 μM，moi = 0.03；26.06 μM，moi = 0.05），優於法匹拉韋（EC50 = 66.85 μM，moi = 0.05）2倍以上；臨床中若通過首日負荷給藥，以10 mg/天的低劑量來氟米特便可維持較高的血藥治療濃度，提示老藥來氟米特或特立氟胺可能具有較好的抗新冠病毒的臨床應用潛力。
為驗證DHODH抑制劑在體內廣譜抗病毒方面的應用可行性，文章採用了從體內藥效驗證到DHODH基因敲除到病毒基因組複製量化檢測，再到基因組複製所需不同原料補給的實驗設計策略抽絲剝繭，最終首次在動物體內證實了DHODH可作為廣譜抗RNA病毒的有效治療靶點。
分別使用甲型流感病毒感染的動物模型、達菲（Oseltamivir）耐藥病毒株NAH275Y感染的動物模型及Oseltamivir不敏感病毒株SC09感染的動物模型證實了S312不僅具有與DAA藥物同等的功效，並且在對抗DAA耐藥病毒時更具優勢。
通過使用CRISPR/Cas9基因敲除技術建立DHODH-/-A549細胞系，發現H1N1流感病毒在DHODH-/-細胞株上的增長較WT細胞株而言明顯降低且不影響細胞的正常生長，證明DHODH是流感病毒複製所需的重要宿主酶。
使用流感病毒微型複製子系統來量化病毒基因組複製，發現S312和S416通過抑制病毒RNA複製發揮廣譜抗病毒作用。
通過向流感病毒微型複製子系統分別添加A, G, U, C四種核苷酸觀察其對流感病毒的拯救效果，發現只有添加U和C而非A和G可拯救流感病毒複製被抑制的效果，表明S312靶向嘧啶合成酶；通過分別向病毒複製子系統補充DHODH的底物二氫乳清酸（DHO）和產物乳清酸（ORO），發現ORO而非DHO的加入能劑量依賴性地拯救被抑制的流感病毒複製，表明S312通過靶向DHODH，抑制病毒基因組的複製。DHODH是嘧啶從頭合成途徑的關鍵酶，因此，本項目發現的DHODH候選藥物若與嘧啶補救途徑抑制劑聯用，將進一步提高藥物的抗病毒活性。
接著，文章在流感病毒感染的重症小鼠體內模型上證實了S312比達菲（Oseltamivir）更具顯著優勢的治療效果，進而提出DAA和HTA的組合用藥是抗病毒治療的一種有效策略。在病毒感染中後期（感染後5-9天），達菲已失去治療效果，而S312仍能發揮50%的小鼠拯救作用，若與達菲聯合用藥則能發揮100%的拯救效果。
急性病毒感染，如流感、新冠肺炎在感染晚期機體會產生過度炎症反應進而誘發「細胞因子風暴」。文章在流感病毒感染小鼠後第14天檢測了達菲與S312聯用前後的疾病小鼠肺泡灌洗液，發現DHODH抑制劑可降低IL6, MCP-1, IL5, KC/GRO(CXCL1), IL2, IFN-γ, IP-10, IL9, TNF-α, GM-CSF, EPO, IL12p70, MIP3α及IL17A/F等炎症因子的水平，預示DHODH抑制劑不僅可以有效切斷核酸來源抑制病毒複製，還可能抑制過度炎症因子的表達和釋放，在感染中晚期起到抗病毒、抗炎雙重效果。
本文不僅發現並驗證了靶向宿主細胞的DHODH抑制劑能夠通過抑制病毒複製和調節免疫兩種途徑發揮廣譜抗病毒藥效，還提示老藥來氟米特或特立氟胺可能具有較好的抗新冠病毒的臨床應用潛力，可滿足目前新冠病毒肺炎臨床急需。同時，新設計的候選藥物S312和S416也有望開發成為抗RNA病毒的候選新藥，為將來冠狀病毒及其它RNA病毒的急性感染性疾病防控戰做好了候選藥物的儲備。
目前，老藥來氟米特已在武漢大學人民醫院開展對新冠肺炎（COVID-19）的臨床試驗，該研究是一項針對中度、重症的病人的多中心、隨機、雙盲、對照性臨床實驗（臨床註冊號：ChiCTR2000030058）。前期的同情性用藥結果表明，口服來氟米特的病人排毒時間（中位期5天）明顯短於相同治療條件下的對照病人（中位數11天），具有統計學的顯著性差異p=0.046。同時，用藥組病人反應急性炎症C反應蛋白水平明顯下降，佐證了該藥物的抗病毒、抗炎雙效作用。此外，作為新概念抗新冠病毒藥物，來氟米特於2020年5月29日獲得全球醫藥創新領域知名公益科研機構英國生命愛科（LifeArc）的全額資助（150萬英鎊），用於與英方臨床專家共同負責開展國際多中心臨床試驗研究（DEFEAT-COVID study），李洪林教授是該臨床試驗的發起人和首席科學家，目前已獲得英國藥品和保健品管理局(MHRA)的臨床試驗批文，開始在Ashford and St Peters Hospital招募COVID-19病人。
值得一提的是，中科院上海藥物所蔣華良院士與許葉春研究員在同期Protein & Cell雜誌上對該研究發表了Highlight文章Potential treatment of COVID-19 by inhibitors of human dihydroorotate dehydrogenase。
在該文章中，蔣院士提及和回顧了以Mpro、RdRp和S蛋白作為靶點的直接抗病毒藥物（Direct-acting antiviral agents，DAA）的重要研究以及潛力。作為抗病毒的另一種策略，以宿主因子為靶點的抗病毒藥物（Host-targeting antiviral, HTA）在耐藥性以及廣譜性上具有一定的優勢，比如抗HIV藥物Maraviroc就是一種HTA，靶標是CCR5。而在此項研究中，李洪林/徐可團隊報導了一種針對SARS-CoV-2的HTA——DHODH（二氫乳清酸脫氫酶）抑制劑。
DHODH是催化嘧啶核苷酸從頭合成途徑第四步氧化還原反應的關鍵酶。抑制DHODH的活性，可抑制嘧啶鹼基的從頭合成，從而抑制快速增殖的淋巴細胞/腫瘤細胞或病毒的DNA和RNA的生物合成，起到抗自身免疫性疾病，抗癌和抗病毒的作用（詳見上文中解讀）。
李洪林/徐可團隊針對DHODH設計並獲得了兩種新抑制劑S312和S416，與已有DHODH抑制劑——來氟米特（Leflunomide）的活性代謝產物特立氟胺（Teriflunomide）一樣，其對甲型流感（H1N1，H3N2，H9N2），Zika、Ebola病毒和SARS-CoV-2病毒都顯示出了廣譜抗病毒活性。尤其是針對SARS-CoV-2病毒，比瑞德西韋強45倍；比氯喹的活性強60餘倍，是目前已報導的體外抑制活性最強的抗SARS-CoV-2候選化合物。另外，DHODH抑制劑S312與oseltamivir聯用也顯示出了可以降低動物模型中炎症因子水平的潛力。而SARS-CoV和SARS-CoV-2患者中也會出現炎症風暴，所以DHODH抑制劑在這一方面也具有潛力。
總之，這一工作揭示了DHODH可以作為一個極具吸引力的抗病毒靶點通過「兩手抓」策略（抗病毒+免疫調節）實現廣譜抗病毒的目的，為SARS-CoV-2和其它RNA病毒提供更多的治療方案。S312和S416具有良好的成藥性和藥代動力學特點，可以作為候選HTA藥物用於COVID-19治療研究。目前DHODH的抑制劑來氟米特治療COVID-19的臨床試驗已經在英格蘭開展，並由LifeArc發起。
原文連結：
http://www.protein-cell.org/en/article/doi/10.1007/s13238-020-00768-w
評論連結：
https://link.springer.com/content/pdf/10.1007/s13238-020-00769-9.pdf
參考文獻
向上滑動閱覽
(1)https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/situation-reports/20200804-covid-19-sitrep-197.pdf
(2) Hoffmann, H.-H.; Kunz, A.; Simon, V. A.; Palese, P.; Shaw, M. L. Broad-spectrum antiviral that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 2011, 108 (14), 5777-5782.
(3) Marschall, M.; Niemann, I.; Kosulin, K.; Bootz, A.; Wagner, S.; Dobner, T.; Herz, T.; Kramer, B.; Leban, J.; Vitt, D. Assessment of drug candidates for broad-spectrum antiviral therapy targeting cellular pyrimidine biosynthesis. Antiviral Res. 2013, 100 (3), 640-648.
(4) Adalja, A.; Inglesby, T. Broad-Spectrum Antiviral Agents: A Crucial Pandemic Tool. Expert Rev. Anti Infect. Ther. 2019, 17 (7), 467-470.
(5) Boldescu, V.; Behnam, M. A.; Vasilakis, N.; Klein, C. D. Broad-spectrum agents for flaviviral infections: dengue, Zika and beyond. Nat. Rev. Drug Discov. 2017, 16 (8), 565.
(6) Martinez, J.; Sasse, F.; Brönstrup, M.; Diez, J.; Meyerhans, A. Antiviral drug discovery: broad-spectrum drugs from nature. Nat. Prod. Rep. 2015, 32 (1), 29-48.
(7) Diao, Y. Y.; Lu, W. Q.; Jin, H. T.; Zhu, J. S.; Han, L.; Xu, M. H.; Gao, R.; Shen, X.; Zhao, Z. J.; Liu, X. F.; Xu, Y. F.; Huang, J.; Li, H. L. Discovery of diverse human dihydroorotate dehydrogenase inhibitors as immunosuppressive agents by structure-based virtual screening. J. Med. Chem. 2012, 55 (19), 8341-8349.
(8) Zhu, J.; Han, L.; Diao, Y.; Ren, X.; Xu, M.; Xu, L.; Li, S.; Li, Q.; Dong, D.; Huang, J.; Liu, X.; Zhao, Z.; Wang, R.; Zhu, L.; Xu, Y.; Qian, X.; Li, H. Design, synthesis, X-ray crystallographic analysis, and biological evaluation of thiazole derivatives as potent and selective inhibitors of human dihydroorotate dehydrogenase. J. Med. Chem. 2015, 58 (3), 1123-1139.
(9) Li, S.; Luan, G.; Ren, X.; Song, W.; Xu, L.; Xu, M.; Zhu, J.; Dong, D.; Diao, Y.; Liu, X.; Zhu, L.; Wang, R.; Zhao, Z.; Xu, Y.; Li, H. Rational design of benzylidenehydrazinyl-substituted thiazole derivatives as potent inhibitors of human dihydroorotate dehydrogenase with in vivo anti-arthritic activity. Sci. Rep. 2015, 5, 14836.
(10) Donahue, K. E.; Gartlehner, G.; Jonas, D. E.; Lux, L. J.; Thieda, P.; Jonas, B. L.; Hansen, R. A.; Morgan, L. C.; Lohr, K. N. Systematic review: comparative effectiveness and harms of disease-modifying medications for rheumatoid arthritis. Ann. Intern. Med. 2008, 148 (2), 124-134.
(11) Wang, M.; Cao, R.; Zhang, L.; Yang, X.; Liu, J.; Xu, M.; Shi, Z.; Hu, Z.; Zhong, W.; Xiao, G. Remdesivir and chloroquine effectively inhibit the recently emerged novel coronavirus (2019-nCoV) in vitro. Cell Res. 2020, 30 (3), 269-271.
(12) Prakash A, Jarvis B. Leflunomide. Drugs,1999,58(6),1137-1164.
(13) https://www.lifearc.org/funding/covid-19-funding-2/defeat-covid-study/.
本文轉載自公眾號「BioArt」（BioGossip）
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原標題：《【科技前沿】專家點評：李洪林/徐可團隊發現靶向宿主DHODH的強效抗新冠病毒候選和臨床已有藥物》
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