結晶紫法:
1.體外細胞培養結束後,去培養液,加入11%的戊二醛固定,置于振蕩器上搖20min。
2.固定細胞用去離子水洗滌至戊二醛液洗淨。
3.置空氣或烘箱37℃徹底乾燥。
4.加入0.1%的結晶紫液對細胞染色,振搖30min。
5.用蒸餾水洗滌,至多餘的結晶紫液衝洗乾淨。
6.置空氣或37℃烘箱中徹底乾燥。
7.加入10%的乙酸對細胞吸收的結晶紫進行提取。
8.1h後在酶標儀上測定光吸收度,波長595nm。
rdU標記法:
1.細胞以1.5×105/ml細胞數接種於直徑35ml培養皿中(內放置一蓋玻片),培養1天,用含0.4% FCS培養液同步化3天,使絕大多數細胞處於G0期。
2.終止細胞培養前,加入BrdU(終濃度為30μg/L),37℃,孵育40min。
3.棄培養液,玻片用PBS洗滌3次。
4.甲醇/醋酸固定10min。
5.經固定的玻片空氣乾燥,0.3%H2O2-甲醇30min滅活內源性氧化酶。
6.5%正常兔血清封閉。
7.甲醯胺100℃,5min變性核酸。
8.冰浴冷卻後PBS洗滌,加1抗即抗小鼠BrdU單抗(工作濃度1:50),陰性對照加PBS或血清。
9.按ABC法進行檢測,蘇木素或伊紅襯染,在顯微鏡下隨機計數10個高倍視野中細胞總數及BrdU陽性細胞數,計算標記指數(LI)