你這廂線粒體裡興風作浪，他在那細胞核裡助紂為虐

按：細胞質雄性不育不僅是作物雜種優勢利用的一把利劍，也是研究核質互作的理想系統，因此受到國內外研究人員的廣泛關注。這篇文章是玉米CMS-S系統的不育機理研究，研究結果給我們展示了一種新的胞質不育機理，值得細讀

。

細胞質雄性不育是由線粒體基因組與核基因互作引起的。CMS（Cytoplasmic male sterility ）是由線粒體中的基因調控並表現為母性遺傳，其育性可由位於核基因組的育性恢復基因（Rf）恢復，當核基因組中Rf基因缺失時，植株表現為配子體或花粉敗育而雌性生殖器官正常。因此，我們可以利用基於CMS的「三系」系統進行雜種優勢利用，其分別為CMS不育系，保持系和恢復系。

目前玉米中主要有三種細胞質雄性不育類型，分別為：CMS-C,CMS-T和CMS-S。在線粒體基因組中除了胞質不育基因外，還有一系列編碼電子轉運鏈複合物和細胞色素c亞基的基因。大多數線粒體複合亞基以及其他線粒體蛋白其實都是在細胞核中轉錄，在細胞質中合成，並最終被轉運到線粒體中發揮功能的。因此，線粒體編碼基因的精確表達對於蛋白質複合物的組裝和植物細胞的存活至關重要。線粒體功能的協調需要順行（anterograde，核到線粒體）和逆行（retrograde，線粒體到核）信號的調控。例如，線粒體信號中的活性氧（ROS）和胞內Ca2+信號可以被傳遞到細胞核內，調控核基因的表達，進而影響順行控制信號。

雖然之前有研究報導，玉米的CMS-S系統的育性轉換與orf355-orf77的轉錄相關，但CMS基因調控雄性不育的機制還是不為人所知。近日，中科院遺傳發育研究所陳化榜課題組和北京市農林科學院趙久然課題組合作在Molecular Plant上發表了題為「Activation of Mitochondrialorf355Gene Expression by A Nuclear-Encoded DREB Transcription Factor Causes Cytoplasmic Male Sterility in Maize」的研究文章，揭示了玉米CMS-S胞質不育系統的育性調控機理，為該不育系統在玉米雜種優勢利用中的應用奠定了理論基礎。

首先通過轉基因驗證的方法，作者確認了線粒體基因組中的orf355就是玉米CMS-S的不育基因，MTS-orf355-GFP轉基因單株表現為雄性不育表型（圖1B-D），orf355蛋白對大腸桿菌細胞具有致死效應，可以導致細胞裂解並降低細胞密度（圖1E,F）。

圖1 orf355是CMS-S玉米的不育基因

orf355主要在花葯小孢子發育的10-12階段（stage10-12）表達（圖2C）。細胞學觀察發現，不育系花葯發育異常發生在花發育的第10階段（stage10，large vacuole stage），小孢子中單層膜和類似過氧化物酶體的結構增加，其內幾乎沒有觀察正常結構的線粒體（圖2A6）。H2DCFDA染色檢測小孢子內源ROS水平發現，不育小孢子ROS水平在第10階段時要顯著高於可育材料，到第11階段時這種差異更甚（圖2E,F）。

圖2 CMS表型分析

為了研究不育發生的分子機理，作者通過酵母單雜篩選到了一個與orf355啟動子互作的CBF/DREB轉錄因子家族蛋白ZmDREB1.7。酵母單雜中，EMSA和LUC表達系統檢測均顯示，ZmDREB1.7可以直接結合到orf355啟動子的CRT/DRE區段調控orf355的轉錄（圖3）。

圖3 ZmDREB1.7與orf355啟動子的CRT/DRE元件直接結合

亞細胞定位（圖4A,C）和免疫雜交結果證明（圖4B），ZmDREB1.7定位在細胞核，線粒體和胞質中。

圖4 ZmDREB1.7蛋白定位於細胞核，細胞質和線粒體中

為了進一步研究ZmDREB1.7基因在雄性不育調控中的功能，作者首先確認該基因是一個花葯特異表達的轉錄因子（圖5A）。進一步分析了106個自交系材料中啟動子變異，發現在一些材料中啟動子區由於-84位22bp鹼基的缺失導致了ZmDREB1.7表達量降低。作者將這個等位基因命名為Δpro（圖5B-E）。將Δpro等位基因轉育到Zheng58-S不育系後發現，即使沒有恢復基因，S-rf3/Δpro材料中也會有花粉產生（圖5F）。而且，在S-rf3/Δpro植株中，orf355的轉錄量相對於不育系降低很多（圖5H）。這說明，ZmDREB1.7確實直接參與了S-型小孢子雄性不育的調控。

圖5 ZmDREB1.7介導CMS-S玉米雄性不育

比較ZmDREB1.7基因在不育系（S-type cytoplasm）和正常材料（N-type cytoplasm）中的表達發現，其轉錄水平在第10-12階段顯著上升，尤其是在不育系中這種上升現象更為明顯，這與orf355表達變化趨勢一致（圖6A）。這似乎暗示著ZmDREB1.7可能受orf355的反饋調控。進一步研究證實，ZmDREB1.7啟動子上的UPR motif可以響應線粒體脅迫信號（ROS等）（AA,抗黴素A（AA）4線粒體電子傳遞的抑制劑，以及H2O2處理結果，圖6B,C）。於是作者進一步猜測，orf355的表達可能激活了線粒體的逆行調節。交替氧化酶(alternative oxidase，AOX)是植物體線粒體內膜上的線粒體呼吸鏈中抗氰呼吸途徑(cyanide-resistant respiration pathway)的末端氧化酶，被認為是植物線粒體逆行調節的傑出模型。因此，作者利用雌二醇誘導表達系統檢測orf355對AOX的誘導表達，可以看到，在雌二醇處理後，orf355轉錄水平迅速增加（圖6D）。同時AOX1a的轉錄也升高（圖6E）。AA處理後也可以看到類似表達模式。除此之外，orf355還可以刺激諸如線粒體伴侶基因AtHscA1和AtsHSP23.5這類的線粒體逆行反應基因（圖6F,G）。線粒體中降解受損蛋白的蛋白酶基因LON1也可以在響應orf355後增加轉錄量（圖6H）。這些結果都表明，orf355的表達可以誘導線粒體逆行反應相關基因的轉錄，這些逆行信號可以進一步刺激ZmDREB1.7342的表達。

圖6 ZmDREB1.7的轉錄水平受orf355介導的線粒體逆行信號調節

總的來說，本研究鑑定出了玉米CMS-S細胞質不育系統的不育基因orf355，發現轉錄因子ZmDREB1.7可以直接結合在orf355啟動子區的UPR motif調控CMS基因orf355在線粒體中的表達。同時，線粒體中的orf355也可以激活線粒體逆行信號，誘導核內ZmDREB1.7的表達。ZmDREB1.7-orf355表達模塊在花葯小孢子發育的後期被觸發，從而導致orf355的大量積聚，產生雄性不育（圖7）。

圖7 玉米CMS-S形成機理模型

油菜雄性不育

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按：細胞質雄性不育不僅是作物雜種優勢利用的一把利劍，也是研究核質互作的理想系統，因此受到國內外研究人員的廣泛關注。這篇文章是玉米CMS-S系統的不育機理研究，研究結果給我們展示了一種新的胞質不育機理，值得細讀。

細胞質雄性不育是由線粒體基因組與核基因互作引起的。CMS（Cytoplasmic male sterility ）是由線粒體中的基因調控並表現為母性遺傳，其育性可由位於核基因組的育性恢復基因（Rf）恢復，當核基因組中Rf基因缺失時，植株表現為配子體或花粉敗育而雌性生殖器官正常。因此，我們可以利用基於CMS的「三系」系統進行雜種優勢利用，其分別為CMS不育系，保持系和恢復系。

目前玉米中主要有三種細胞質雄性不育類型，分別為：CMS-C,CMS-T和CMS-S。在線粒體基因組中除了胞質不育基因外，還有一系列編碼電子轉運鏈複合物和細胞色素c亞基的基因。大多數線粒體複合亞基以及其他線粒體蛋白其實都是在細胞核中轉錄，在細胞質中合成，並最終被轉運到線粒體中發揮功能的。因此，線粒體編碼基因的精確表達對於蛋白質複合物的組裝和植物細胞的存活至關重要。線粒體功能的協調需要順行（anterograde，核到線粒體）和逆行（retrograde，線粒體到核）信號的調控。例如，線粒體信號中的活性氧（ROS）和胞內Ca2+信號可以被傳遞到細胞核內，調控核基因的表達，進而影響順行控制信號。

雖然之前有研究報導，玉米的CMS-S系統的育性轉換與orf355-orf77的轉錄相關，但CMS基因調控雄性不育的機制還是不為人所知。近日，中科院遺傳發育研究所陳化榜課題組和北京市農林科學院趙久然課題組合作在Molecular Plant上發表了題為「Activation of Mitochondrial orf355 Gene Expression by A Nuclear-Encoded DREB Transcription Factor Causes Cytoplasmic Male Sterility in Maize」的研究文章，揭示了玉米CMS-S胞質不育系統的育性調控機理，為該不育系統在玉米雜種優勢利用中的應用奠定了理論基礎。

首先通過轉基因驗證的方法，作者確認了線粒體基因組中的orf355就是玉米CMS-S的不育基因，MTS-orf355-GFP轉基因單株表現為雄性不育表型（圖1B-D），orf355蛋白對大腸桿菌細胞具有致死效應，可以導致細胞裂解並降低細胞密度（圖1E,F）。

圖1 orf355是CMS-S玉米的不育基因

orf355主要在花葯小孢子發育的10-12階段（stage10-12）表達（圖2C）。細胞學觀察發現，不育系花葯發育異常發生在花發育的第10階段（stage10，large vacuole stage），小孢子中單層膜和類似過氧化物酶體的結構增加，其內幾乎沒有觀察正常結構的線粒體（圖2A6）。H2DCFDA染色檢測小孢子內源ROS水平發現，不育小孢子ROS水平在第10階段時要顯著高於可育材料，到第11階段時這種差異更甚（圖2E,F）。

圖2 CMS表型分析

為了研究不育發生的分子機理，作者通過酵母單雜篩選到了一個與orf355啟動子互作的CBF/DREB轉錄因子家族蛋白ZmDREB1.7。酵母單雜中，EMSA和LUC表達系統檢測均顯示，ZmDREB1.7可以直接結合到orf355啟動子的CRT/DRE區段調控orf355的轉錄（圖3）。

圖3 ZmDREB1.7與orf355啟動子的CRT/DRE元件直接結合

亞細胞定位（圖4A,C）和免疫雜交結果證明（圖4B），ZmDREB1.7定位在細胞核，線粒體和胞質中。

圖4 ZmDREB1.7蛋白定位於細胞核，細胞質和線粒體中

為了進一步研究ZmDREB1.7基因在雄性不育調控中的功能，作者首先確認該基因是一個花葯特異表達的轉錄因子（圖5A）。進一步分析了106個自交系材料中啟動子變異，發現在一些材料中啟動子區由於-84位22bp鹼基的缺失導致了ZmDREB1.7表達量降低。作者將這個等位基因命名為Δpro（圖5B-E）。將Δpro等位基因轉育到Zheng58-S不育系後發現，即使沒有恢復基因，S-rf3/Δpro材料中也會有花粉產生（圖5F）。而且，在S-rf3/Δpro植株中，orf355的轉錄量相對於不育系降低很多（圖5H）。這說明，ZmDREB1.7確實直接參與了S-型小孢子雄性不育的調控。

圖5 ZmDREB1.7介導CMS-S玉米雄性不育

比較ZmDREB1.7基因在不育系（S-type cytoplasm）和正常材料（N-type cytoplasm）中的表達發現，其轉錄水平在第10-12階段顯著上升，尤其是在不育系中這種上升現象更為明顯，這與orf355表達變化趨勢一致（圖6A）。這似乎暗示著ZmDREB1.7可能受orf355的反饋調控。進一步研究證實，ZmDREB1.7啟動子上的UPR motif可以響應線粒體脅迫信號（ROS等）（AA,抗黴素A（AA）4線粒體電子傳遞的抑制劑，以及H2O2處理結果，圖6B,C）。於是作者進一步猜測，orf355的表達可能激活了線粒體的逆行調節。交替氧化酶(alternative oxidase，AOX)是植物體線粒體內膜上的線粒體呼吸鏈中抗氰呼吸途徑(cyanide-resistant respiration pathway)的末端氧化酶，被認為是植物線粒體逆行調節的傑出模型。因此，作者利用雌二醇誘導表達系統檢測orf355對AOX的誘導表達，可以看到，在雌二醇處理後，orf355轉錄水平迅速增加（圖6D）。同時AOX1a的轉錄也升高（圖6E）。AA處理後也可以看到類似表達模式。除此之外，orf355還可以刺激諸如線粒體伴侶基因AtHscA1和AtsHSP23.5這類的線粒體逆行反應基因（圖6F,G）。線粒體中降解受損蛋白的蛋白酶基因LON1也可以在響應orf355後增加轉錄量（圖6H）。這些結果都表明，orf355的表達可以誘導線粒體逆行反應相關基因的轉錄，這些逆行信號可以進一步刺激ZmDREB1.7342的表達。

圖6 ZmDREB1.7的轉錄水平受orf355介導的線粒體逆行信號調節

總的來說，本研究鑑定出了玉米CMS-S細胞質不育系統的不育基因orf355，發現轉錄因子ZmDREB1.7可以直接結合在orf355啟動子區的UPR motif調控CMS基因orf355在線粒體中的表達。同時，線粒體中的orf355也可以激活線粒體逆行信號，誘導核內ZmDREB1.7的表達。ZmDREB1.7-orf355表達模塊在花葯小孢子發育的後期被觸發，從而導致orf355的大量積聚，產生雄性不育（圖7）。

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