利用螢光顯微鏡高通量測定微生物出生及死亡速度

2021-01-09 生物谷

      微生物通常生長在營養濃度有波動的環境中，定量研究微生物在這些環境下的適應性（淨生長速度）對理解微生物的進化及生態至關重要。

      通常測定微生物生長速度的方法有兩種：即光密度測定法和流式細胞儀測定法。由於光密度測定法不能區分活細胞和死細胞的濃度，流式細胞儀法雖然可以區分死細胞和活細胞，但其操作比較複雜。最近，由美國Fred Hutchinson Cancer Research Center的 教授團隊在Quantitative Biology上發表了題為「High-throughput quantification of microbial birth and death dynamics using fluorescence microscopy」文章（

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。該文詳細介紹了如何利用螢光顯微鏡技術定量研究微生物的生長及死亡速度。


文章概要

        為了能夠自動測定螢光酵母的生長及死亡速度，作者首先對螢光顯微鏡進行了設置（如圖1），即對常規的螢光顯微鏡補加一些附件。恆溫罩（Enclosure）保持細胞樣品溫度，自動移動的平臺（Motorized stage）可以重複對很多樣品用明場和螢光進行拍照，自動轉換的濾片（Motorized filter cubes）可以自動進行濾片切換，ITO Lid warmer（熱蓋玻璃）則避免了拍照過程中水蒸氣在蓋子上的凝結。此外，作者還專門寫了一個「LabVIEW」程序，該程序可以自動在明場對焦，然後轉到螢光下對

酵母

進行拍照，從而減少光毒性對微生物生長的影響。

圖1. 螢光顯微鏡的設置

      通過上述螢光顯微鏡的設置，作者對lys2-和ade8-這兩種酵母的生長及死亡速率進行了測定，並比較了不同測定方法的結果。lys2-和ade8-是兩種分別需要Lys（賴氨酸）和Ade（腺嘌呤）才能成長

酵母

突變體。結果表明，lys2-和ade8-分別在缺乏Lys和Ade的培養基中生長時，其死亡速度均呈現出時間依賴性；並且它們的死亡速度分別與Lys和Ade的濃度有關（如圖2）。此外，螢光顯微鏡自動檢測法與手動檢測法及流式細胞儀檢測法相比，其結果與後兩種的檢測結果基本一致（如圖2）。

圖2. lys2-和ade8-的死亡率具有時間和營養物濃度依賴性

       另外，作者發現極低濃度的營養可能不會被微生物消耗，並且低濃度營養物會導致不同菌株以不同的速度死亡和出生（如圖3）。其原因可能是菌株沒有在低濃度營養物培養的條件下進化過，因此不同基因型產生不同的生長速度。

圖3. 低濃度營養物培養條件下lys2-和ade8-的出生及死亡速率

      此外，在描述lys2-和ade8-的細胞生長速度時，作者發現Moser（S-型）模型要優於Monod模型。

      最後，作者希望通過這種高通量螢光顯微鏡定量測定法，能為今後螢光微生物生長的測定提供一種簡單，快速，準確的方法。目前，該方法已被成功用於測定原始和進化菌種的生長速度，相關成果發表在eLife中（https://elifesciences.org/articles/44812）。

Reference

1. Hart, S.F.M., Skelding, D., Waite, A.J. et al. (2019) High-throughput quantification of microbial birth and death dynamics using fluorescence microscopy. Quant Biol 7: 69.

2. Hart, S.F.M., Pineda, J.M.B., Chen, Chi-Chun, Green, R. and Shou, W. (2019) Disentangling strictly self-serving mutations from win-win mutations in a mutualistic microbial community. eLife 8: 44812

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