前言：新冠病毒的肆虐突然就將原本對分子生物學了解不多的人們拉近了與分子檢測的距離。目前的新冠病毒核酸檢測絕大多數都是採用螢光定量PCR方法，對病毒RNA運用逆轉錄後PCR的方式擴增目的序列進行檢測。這裡再次對PCR實驗進行簡單介紹。
聚合酶鏈式反應，PCR(polymerase chain reaction):，是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術；是指在引物存在的條件下，以DNA為模板，由DNA聚合酶催化的對特定基因或DNA序列進行體外快速擴增的反應，又稱為基因體外擴增法。
螢光定量PCR技術，是在PCR反應體系中加入螢光報告系統，利用螢光信號的變化對PCR過程進行實時監控，實現對起始模板的定量檢測。
1. 螢光定量PCR幾個基礎概念：
基線：是指擴增曲線的水平部分。是指在PCR擴增反應的最初數個循環裡，螢光信號變化不大。接近一條直線，這樣的直線即是基線。每個樣品孔都設置獨立基線。
閾值：是一個螢光強度值，螢光域值必須設定在 PCR擴增的指數期。
閾值線：穿過閾值與X軸平行的直線稱為閾值線；
Ct值：是閾值線與擴增曲線的交點對應在X軸上的值，是循環數。
2. 螢光定量PCR技術為什麼可以用來做精確定量檢測：
典型的擴增曲線包括基線期，指數增長期，線性增長期和平臺期；
基線期雖然在進行指數擴增，但是螢光信號變化不大；
指數增長期在進行指數擴增，螢光信號也在以指數增長；
線性增長期雖然螢光在增長，但其增長無明確的數學關係；
平臺期螢光幾乎無增長，說明反應體系內DNA含量基本穩定，幾乎不在增加。
以上4個時期是根據其擴增過程中的特徵人為劃分的，之間並無明確的界限；且只有在基線期和指數期是保持嚴格的數學關係進行指數擴增的；所以將閾值線劃在指數增上期，得到的CT值可以用來代表起始模板量，故可以用來做精確的定量檢測。
3. 螢光定量PCR檢測流程：
螢光定量PCR檢測一般流程如下圖，選擇檢測靶標基因，進行引物篩選及體系構建，後續進行樣本處理核酸提取，檢測分析結果。
4. 螢光定量PCR實驗設計：
4.1 設置對照組：
螢光定量PCR檢測一般流程如下圖，選擇檢測靶標基因，進行引物篩選及體系構建，後續進行樣本處理核酸提取，檢測分析結果。
對照組是實驗的監控系統，監測實驗是否有存在異常，也是排除實驗異常關鍵所在；
實驗對照設置: 通常有陽性對照，陰性對照組等。
具體可根據實驗類型進行對照組的設置；對照組是實驗分析的依據，對照組設置的充分合理。
4.2重複試驗：
實驗是否具備重現性是可信度的體現；一般螢光定量PCR都會做3個PCR復孔；不過PCR復孔處於實驗流程的最末端，只是對PCR操作的重複；重複性可設計在逆轉錄、樣本提取等的重複操作，統計得到實驗的重現性。
根據實際情況選擇重複實驗的設置；重複的意義從低到高依次為：PCR復孔，逆轉錄復孔，樣本重複，實驗重複；整個實驗具備重複性說明實驗可信度很好。
5. 螢光定量PCR數據分析：
首先看基線與閾值設置的是否合理；在基線和閾值設置合理的基礎上，得到的CT值才是準確可靠的；在CT值是準確的基礎上再進行相對定量或絕對定量實驗。
5.1 絕對定量實驗數據分析注意要點：
5.1.1 絕對定量實驗對檢測體系的擴增效率不做硬性要求；
5.1.2 檢測的樣本濃度必須落在標曲線性範圍之內；否則該樣本檢測濃度不在此標曲有效範圍內，需要根據實際情況擴大標曲的範圍或對樣本進行稀釋或濃縮使之落在標曲線性之內；
5.1.3 標曲與待測樣本必須在同一趟實驗上進行才有效，不可用不同趟實驗的標曲進行絕對定量計算；
5.2 相對定量實驗數據分析注意要點：
5.2.1 相對標準曲線法：注意要點同絕對定量；
5.2.2 2的-δδCt法： 本方法要求靶標基因和內參基因的擴增效率儘可能相等且接近100%； 參比樣本
和實驗樣本的靶標基因和內參基因在同一趟實驗中進行檢測；
6.0 螢光定量PCR操作注意點：
螢光定量PCR屬於精密性試驗，需要專業人員操作，在操作過程中需要注意各方面細節實驗以保證實驗的可靠可重複性。
6.1 螢光定量PCR操作注意點：
實驗室注意分區：試劑準備間，樣本處理間，PCR室，電泳間要有明確區分，各房間實驗室的實驗服不得混用；
試劑準備間及樣本處理間不處理實驗相關的高濃度的核酸模板（如高濃度的標準品，PCR產物，miRNA的minics等）；
減少頻繁多次的走動，尤其去過電泳間之後當天不可進入其他房間；
使用生物安全櫃加樣，不同位置的移液器不可混用，不要隨意更換其位置；
在檢測體系中添加UNG酶系統用於避免PCR產物的汙染。
6.2 試劑質量控制：
對每批次配製或購買的試劑進行質檢，保證試劑的性能穩定可控，均一。
6.3 試劑使用注意事項：
試劑使用前必須混勻。
6.4 移液器操作注意事項：
使用結束後調整至最大量程，取樣時槍頭深入頁面的深度儘量一直保持在1-2mm之間，避免外壁沾過多試劑隨加樣進入導致重複性不好。
6.5 反應液配製及注意事項：
加樣使用合適量程的移液器；對於較小體積的移液，取液時候，不可深入液體太多以免試劑沾到吸頭外壁至移液量不準確，深入1-2mm即可（尤其是粘稠試劑，如酶，甘油等）；
小體積試劑加樣務必：取液後眼觀是否取到液體，加樣務必浸入混合液一下吹吸數次，棄吸頭前眼觀確定吸頭中無殘留。
6.6 反應液分裝及注意事項：
反應液分裝前必須混勻（比如渦旋震蕩或移液器吹吸混勻）再分裝；反應液第一個孔分裝必須潤一下槍頭，96孔之間加樣間隔時間儘量保持一致，96孔的點樣位置儘量保持在96孔的相同位置，復孔之間儘量相鄰點樣，點樣按照一定的順序，吸取時槍頭深入頁面的深度儘量一直保持在1-2mm之間；
加樣使用移液器鑲緊移液器吸頭，每次按至第一檔即可，不可按至第二檔，避免氣泡產生和加樣不準確（註：這個並不是唯一使加樣準確的方式，只要保持所有孔的加樣方式相同，可減少加樣誤差；）加樣儘量勻速，不要加樣到孔外面，以免對後面封膜造成影響；
點樣結束後，觀察是否有漏加樣本，或加錯樣本。
摘自《吉瑪基因》
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